奶粉中双氰胺的检测方法（HPLC-UV和HPLC-MS/MS法） [复制链接]

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北京时间1月25日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写DICY或DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。 L^2%1GfE{  
本文采用Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管和Venusil^® HILIC液相色谱柱，建立了奶粉中双氰胺的MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。 ^e_hLX\SW  
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1 实验部分 JV^=v@Z3  
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1.1 仪器、试剂与材料 x_N'TjS^{  
高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。 6$Xzpg(o  
双氰胺标准品（CAS： 461-58-5；FW=84.08），Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管，Venusil^® HILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。 [I,Z2G,Jb  
1.2 实验步骤 2/\r)$ 2i  
提取、净化：称取1g试样于50mL具塞离心管中，加入2mL水溶解后，加乙腈定容至10mL，超声10min，8000r/min离心5min，取2mL上清液加入Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管填料，涡旋0.5min，8000r/min离心5min，取上清液过0.22µm滤膜，待测。 |}s*E_/[  
1.3　实验条件 DZ'P@f)]  
1.3.1高效液相色谱法（HPLC法）： Z*] 9E^  
色谱柱：Venusil^® HILIC（5μm，100Å，4.6*250mm）； ;40/yl3r3[  
流动相： 10mmol/L乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=10: 90； 
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波长：220nm；进样量：10µl；柱温：30℃；流速：1mL/min。 ,*TmIPNK  
1.3.2 LC-MS/MS法： J@HtoTDO3  
（1）色谱条件： E1aHKjLQ  
色谱柱：Venusil^® HILIC（ 5μm，100Å，2.1*150mm）； ?DS@e@lx  
流动相： 0.5mmol/L乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=10:90；进样量：10µL；柱温：30℃；流速：0.2 mL/min。 $Ps|HN  
（2）质谱条件： UawyDs  
质谱仪：API 4000+；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；CAD：8.00；CUR：10.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00；TEM：500.00。 +6M}O[LP  

药物名称	监测离子对	DP	EP	CE	CXP
双氰胺	85.1/68.1	71	10	41	6
	85.1/43.1	71	10	41	6

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2.结果与讨论 L:$ ,v^2  
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2.1 高效液相色谱法： g>E LGG|Q  
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2.1.1线性关系和检出限 \S `:y?[Y  
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液； >mbHy<<  
分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为0.1µg/mL，0.5µg/mL，1.0µg/mL，2.0µg/mL，5.0µg/mL和10.0µg/mL的标准溶液，按照上述色谱条件，依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表2：

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	4.92min	Y=116.44X+3.2699	0.9997	0.1µg/ml

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2.1.2检测方法稳定性考察 Fk&c=V;SU  
选用10.0µg/mL的标准溶液连续进样6针，计算其保留时间和峰面积的RSD值，结果见表3：

标号	保留时间/ min	峰面积
1	4.930	1061.7
2	4.933	1072.2
3	4.930	1064.4
4	4.929	1079.7
5	4.930	1067.3
6	4.934	1073.6
RSD，%	0.04	0.62

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2.1.3准确度和精密度 ^`i#$  
选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表4

平行1，%	平行2，%	平行3，%	平均值，%	RSD，%
98.6	88.4	89.8	92.3	5.99

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2.2 LC-MS/MS法 j<m(PHSe  
2.2.1线性关系和检出限 7DogM".}~Q  
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液。 a@K%06A;'
 
分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL和500ng/mL的标准溶液，按照上述液质方法，依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见下表5：

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	3.15min	Y=8777.2X+7435.9	0.9993	5ng/mL

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2.2.2 检测方法稳定性考察 0@0w+&*"@  
选用50.0ng/mL的标准溶液连续进样6针，计算其保留时间和峰面积的RSD值，结果见表6：

标号	保留时间，min	峰面积
1	3.29	382950
2	3.30	387950
3	3.25	382840
4	3.31	399820
5	3.30	378580
6	3.30	383810
RSD，%	0.65	1.92

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2.2.3准确度和精密度 Vi
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选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。

平行1	平行2	平行3	平均值	RSD
84.6%	80.7%	90.2%	85.2%	5.61%