迄今为止,自然界中已发现180多种氨基酸,其中参与蛋白质合成的氨基酸只有20多种,称为基本氨基酸。氨基酸主要有两种存在形式,一种是以游离态存在于生理体液(血浆、尿)、食品(酒、饮料)中,另一种是以结合态存在于肽和蛋白质中。由于氨基酸分析在蛋白质化学、生物化学、食品科学、临床医学等领域的研究中起着重要的作用,因此,对氨基酸分析方法的研究与改进得到人们高度重视。1958年, Spackman等[ 1 ]首先提出了用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质中的氨基酸,实现了氨基酸分析的自动化。其后,人们不断地发展新的氨基酸分析方法,柱前衍生反相高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱2积分脉冲安培检测法等相继应用于氨基酸分析。现已是多种氨基酸分析方法并存、互补。本文就目前应用于氨基酸分析的主要方法作一综述。 ID=^497
2柱后衍生高效阳离子交换色谱法 ^X?3e1om
高效阳离子交换色谱(HPCEC) 2柱后茚三酮衍生光度检测分离测定氨基酸是一种经典的氨基酸分析方法。此方法是利用氨基酸在酸性条件下形成阳离子而在阳离子交换柱中分离,分离后的氨基酸用茚三酮衍生、紫外可见光度检测器检测。采用阳离子交换色谱分离、柱后茚三酮衍生光度检测技术的商品化的自动氨基酸分析仪在20世纪60年代初问世。现在的自动氨基酸分析仪已实现了程控自动化和数据处理电脑化,分析时间已缩短至1 h以内。 ~p/1
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目前,专用氨基酸分析仪的色谱柱主要是以磺酸型强酸性阳离子交换树脂为柱填料。该树脂是由苯乙烯和二乙烯基本聚合后磺化而成,球状树脂的粒度一般在5~10μm之间,交联度多为8%~12%。流动相一般采用3~5种不同pH值的缓冲液(柠檬酸钠或柠檬酸锂等)。氨基酸的分离不仅受离子交换树脂的型号、交联度和粒度的影响,还受柱温、洗脱缓冲液的阳离子类型、pH、离子强度、淋洗梯度、流速以及其中有机溶剂含量的影响。 f,Dj@?3+
由于大多数氨基酸在紫外可见光区无吸收,因此必须将其衍生、转化为具有紫外可见吸收或能产生荧光的物质才能检测。茚三酮是最常用的柱后衍生化试剂。采用茚三酮作柱后衍生试剂的方法被认为是这一技术的标准方法(AOAC采用的氨基酸分析标准方法)。这种方法的优点是准确、可靠、重现性好,能测定大量氨基酸及其同系物。方法的不足是灵敏度不高,只可对100 pmol以上的氨基酸进行准确分析,而且需要双波长检测,在440 nm处检测脯氨酸,在570 nm处检测其它氨基酸[ 2 ]。为了提高分析灵敏度,用荧光胺代替茚三酮作柱后衍生试剂,采用荧光检测,可检测几个pmol的氨基酸[ 3 ]。荧光胺与氨反应的灵敏度比茚三酮与氨反应的灵敏度大约提高了3个数量级。这样,测定中受氨干扰程度较小。但荧光胺不能直接与脯氨酸反应,需通过氧化打开脯氨酸的咪唑环才能衍生[ 4 ]。 v+2t;PJd2
在柱后衍生荧光检测中,邻苯二甲醛(OPA )比荧光胺更常用,检出限一般可达5~10 pmol[ 5 ] ,但需从样品谱图中扣除OPA的本底吸收[ 6 ]。OPA不能直接同脯氨酸反应,需将后者氧化开环后方可衍生。柱后衍生高效阳离子交换色谱法可应用于蛋白质水解液、生理体液、食品等样品中氨基酸的测定。但色谱仪器较复杂,需要通过泵和反应器以保证洗脱液与柱后衍生试剂均匀混合,使仪器局限于一类分析。 ~LN
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3柱前衍生反相高效液相色谱法 bu r0?q
近20年来,柱前衍生反相高效液相色谱法(RP2HPLC)分析氨基酸得到了迅速发展,逐渐取代柱后衍生HPCEC在许多领域中的应用。RP2HPLC分析方法更加灵敏、快速。而且,与局限于氨基酸分析的自动分析仪不同, HPLC仪适用性极广。 Oc?]L&a