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氨基酸的检测方法综述 [复制链接]

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只看楼主正序阅读使用道具楼主发表于: 2023-07-13

关键词：氨基酸色谱法检测

迄今为止,自然界中已发现180多种氨基酸,其中参与蛋白质合成的氨基酸只有20多种,称为基本氨基酸。氨基酸主要有两种存在形式,一种是以游离态存在于生理体液(血浆、尿)、食品(酒、饮料)中,另一种是以结合态存在于肽和蛋白质中。由于氨基酸分析在蛋白质化学、生物化学、食品科学、临床医学等领域的研究中起着重要的作用,因此,对氨基酸分析方法的研究与改进得到人们高度重视。1958年, Spackman等[ 1 ]首先提出了用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质中的氨基酸,实现了氨基酸分析的自动化。其后,人们不断地发展新的氨基酸分析方法,柱前衍生反相高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱2积分脉冲安培检测法等相继应用于氨基酸分析。现已是多种氨基酸分析方法并存、互补。本文就目前应用于氨基酸分析的主要方法作一综述。
　　2柱后衍生高效阳离子交换色谱法
　　高效阳离子交换色谱(HPCEC) 2柱后茚三酮衍生光度检测分离测定氨基酸是一种经典的氨基酸分析方法。此方法是利用氨基酸在酸性条件下形成阳离子而在阳离子交换柱中分离,分离后的氨基酸用茚三酮衍生、紫外可见光度检测器检测。采用阳离子交换色谱分离、柱后茚三酮衍生光度检测技术的商品化的自动氨基酸分析仪在20世纪60年代初问世。现在的自动氨基酸分析仪已实现了程控自动化和数据处理电脑化,分析时间已缩短至1 h以内。
　　目前,专用氨基酸分析仪的色谱柱主要是以磺酸型强酸性阳离子交换树脂为柱填料。该树脂是由苯乙烯和二乙烯基本聚合后磺化而成,球状树脂的粒度一般在5～10μm之间,交联度多为8%～12%。流动相一般采用3～5种不同pH值的缓冲液(柠檬酸钠或柠檬酸锂等)。氨基酸的分离不仅受离子交换树脂的型号、交联度和粒度的影响,还受柱温、洗脱缓冲液的阳离子类型、pH、离子强度、淋洗梯度、流速以及其中有机溶剂含量的影响。
　　由于大多数氨基酸在紫外可见光区无吸收,因此必须将其衍生、转化为具有紫外可见吸收或能产生荧光的物质才能检测。茚三酮是最常用的柱后衍生化试剂。采用茚三酮作柱后衍生试剂的方法被认为是这一技术的标准方法(AOAC采用的氨基酸分析标准方法)。这种方法的优点是准确、可靠、重现性好,能测定大量氨基酸及其同系物。方法的不足是灵敏度不高,只可对100 pmol以上的氨基酸进行准确分析,而且需要双波长检测,在440 nm处检测脯氨酸,在570 nm处检测其它氨基酸[ 2 ]。为了提高分析灵敏度,用荧光胺代替茚三酮作柱后衍生试剂,采用荧光检测,可检测几个pmol的氨基酸[ 3 ]。荧光胺与氨反应的灵敏度比茚三酮与氨反应的灵敏度大约提高了3个数量级。这样,测定中受氨干扰程度较小。但荧光胺不能直接与脯氨酸反应,需通过氧化打开脯氨酸的咪唑环才能衍生[ 4 ]。
　　在柱后衍生荧光检测中,邻苯二甲醛(OPA )比荧光胺更常用,检出限一般可达5～10 pmol[ 5 ] ,但需从样品谱图中扣除OPA的本底吸收[ 6 ]。OPA不能直接同脯氨酸反应,需将后者氧化开环后方可衍生。柱后衍生高效阳离子交换色谱法可应用于蛋白质水解液、生理体液、食品等样品中氨基酸的测定。但色谱仪器较复杂,需要通过泵和反应器以保证洗脱液与柱后衍生试剂均匀混合,使仪器局限于一类分析。
　　3柱前衍生反相高效液相色谱法
　　近20年来,柱前衍生反相高效液相色谱法(RP2HPLC)分析氨基酸得到了迅速发展,逐渐取代柱后衍生HPCEC在许多领域中的应用。RP2HPLC分析方法更加灵敏、快速。而且,与局限于氨基酸分析的自动分析仪不同, HPLC仪适用性极广。
　　RP2HPLC要求将氨基酸在柱前转化为适于反相色谱分离并能被灵敏检测的衍生物。柱前衍生的关键在于衍生试剂的选择。选择衍生试剂的标准是能与各氨基酸定量反应,每种氨基酸只生成一种化合物且产物有一定的稳定性,不产生或易于排除干扰物;操作简单,色谱分离分辨率高,检测灵敏度高,分析时间短,便于实现自动化和使产物能在不同型号的高效液相色谱仪上测定。一些比较常用的柱前衍生试剂列于表1。主要的柱前衍生试剂有邻苯二甲醛(OPA ) [ 7～11 ]、异硫氰酸苯酯( P ITC) [ 12～18 ]、氯甲酸芴甲酯( FMOC2Cl) [ 19～25 ]及丹酰氯(Dansyl2Cl) [ 26～29 ]。

　　在还原剂(β2巯基乙醇或32巯基丙酸)存在下, OPA与一级氨基酸发生衍生反应,衍生物在RP2HPLC柱上分离,根据衍生物荧光特性检测。此方法在仪器自动化方面是可行的。采用OPA衍生方法可在13 m in内,在亚pmol水平,分离测定23种主要生理氨基酸[ 10 ]。OPA衍生法具有样品制备简单、衍生反应迅速、灵敏度高及易于实现自动化操作等优点。此方法的缺点是不能检测仲氨基酸及衍生物不够稳定。后者可通过在线自动衍生分析来克服。用P ITC作柱前衍生试剂的氨基酸分析得到了广泛应用。氨基酸与P ITC反应生成苯氨基硫甲酰衍生物( PTC)。衍生物单一、稳定,衍生反应速度快。
　　这种衍生物经RP2HPLC分离后,用紫外检测( 254nm)。检出限大约是1 pmol。一、二级氨基酸均可被测定。P ITC衍生法在仪器自动化方面也是可行的。此方法已拓展至含磷氨基酸[ 17 ]和含硫氨基酸[ 18 ]等修饰氨基酸的分析。FMOC2Cl衍生法亦是一种常用的柱前衍生法,而且在仪器自动化方面也是可行的。FMOC2Cl可与一级和二级氨基酸生成稳定的衍生物。荧光检测灵敏度可达fmol水平。此方法的缺点是需要将反应过程中剩余的衍生试剂萃取出以中止衍生反应,同时避免衍生物的分解。另外, FMOC2Cl与组氨酸形成单、双衍生物的比例不稳定,影响定量。Dansyl2Cl与包括亚氨基在内的所有氨基酸均起反应,与组氨第3期于泓等:氨基酸分析方法的研究进展993酸形成多种衍生物,与赖氨酸、酪氨酸、胱氨酸形成双丹酰衍生物,与其他氨基酸则形成单丹酰衍生物[ 28 ]。此方法对胱氨酸的线性特别好[ 29 ]。一些柱前衍生方法的主要特点总结于表2。作为柱前衍生试剂, Dansyl2Cl、FDNB、FDNPAA和FDNDEA衍生法的缺点是衍生后生成干扰副产物,并且后3种方法需要通过抽干的方法除去反应剂。
　　FMOC2Cl法的缺点是,为停止衍生反应和防止生成的衍生物自发水解,过量的反应剂必须用戌烷萃取除去[ 23 ]。由于以上几种方法的不足,只有OPA和P ITC被广泛用作柱前反应试剂。衍生后的氨基酸一般在键合C18柱上,根据液液分配原理进行分离。流动相多以乙酸盐或磷酸盐缓冲液为主,以乙腈、甲醇或四氢氟喃为调节剂。由于氨基酸衍生物仍保留着两性化合物的特点,故除改变调节剂之外,还可通过调节缓冲液pH值、离子强度、柱温等使之达到理想的分离。当然,不同衍生物所选用的柱型、流动相以及氨基酸的洗脱时间和顺序不尽相同。柱前衍生反相高效液相色谱法可用于分析蛋白质水解液、生理体液和食品等样品中的氨基酸。

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　　4高效阴离子交换色谱
积分脉冲安培检测法(HPAEC2IPAD )是一种新的氨基酸分析方法。此方法是基于氨基酸分子中的羧基在强碱性介质中可以形成阴离子,而氨基酸分子中的氨基在强碱性介质中通过施加一定的电位,可在贵金属(金、铂)电极表面发生氧化反应,从而实现氨基酸的阴离子交换色谱分离和积分脉冲安培检测。1983年, Polta等[ 41 ]首先提出了用阴离子交换色谱2脉冲安培检测法分析氨基酸。其后,W elch等[ 42 ]对脉冲安培检测氨基酸和积分脉冲安培检测氨基酸进行了比较研究,提出了检测氨基酸的积分脉冲安培检测波形。以上研究工作虽然实现了氨基酸的直接分离检测,但由于存在基线漂移、线性、重现性差、电极损耗大以及无高效阴离子色谱柱分离氨基酸等问题,因此未能使氨基酸的分析达到可应用程度。Clarke等[ 43 ]得到了检测氨基酸的优化波形,采用高效阴离子交换柱,成功地实现了氨基酸的高效阴离子交换色谱分离和积分脉冲安培检测,并将此方法应用于蛋白质水解产物分析。HPAEC2IPAD分析氨基酸不需要对氨基酸进行衍生化处理,可直接进行分离、检测,对氨基酸的检出限为pmol～fmol级。由于糖类化合物(含有多羟基)在强碱性介质中可以形成阴离子并可用脉冲安培法检测,因此,用HPAEC2IPAD亦可分析糖类化合物、氨基糖和糖酸等。Yu等[ 44 ]对影响氨基酸分离和检测的因素进行了详细研究。这些因素包括淋洗液浓度、柱温和检测波形。通过实验得到了分离和检测19种氨基酸的最佳条件,并将这一条件应用于缬氨酸产品中微量氨基酸杂质的测定。Jandik等[ 45 ]采用二模式积分脉冲安培检测(即两种积分脉冲安培检测波形) ,对氨基酸和糖类化合物的混合物进行了分析。糖类化合物的检测电位比氨基酸的检测电位低,在较高的电位下,氨基酸和糖类化合物均被检测,而在较低的积分电位下只检测糖类化合物,氨基酸(羟基氨基酸除外)不被检测或检测信号很弱。这样,对氨基酸和糖类化合物的混合物可选择性地检测糖类化合物。这种二模式积分脉冲安培检测方法可用于氨基酸和糖的鉴定。
　　Yu等[ 46～48 ]详细研究了氨基酸和糖类化合物在阴离子交换柱中的保留行为和积分脉冲安培检测行为,提出了一次进样同时分析氨基酸和糖类化合物的方法,并将方法应用于液体调味品、黄酒和氨基酸注射液中氨基酸和糖类化合物的测定。D ing等[ 49 ]研究了绿茶中氨基酸和糖的分离测定,提出了一个改进的梯度淋洗程序,从而实现了绿茶中茶氨酸与谷氨酰胺的分离,并且葡萄糖、果糖和蔗糖先于中性氨基酸洗脱,避免了相互干扰。
　　由于糖类化合物亦可用HPAEC2IPAD分离和检测,因此,大量糖类化合物的存在对氨基酸的测定有时会产生干扰。对于测定含有大量糖类化合物样品中的氨基酸, Jandik等[ 50 ]提出了一种简单的在线除糖测定氨基酸的方法。首先将样品通过一个短的氢型阳离子交换柱(捕获柱) ,由于在酸性条件下糖类化合物是以分子形式存在,而氨基酸以阳离子形式存在,因此,糖类化合物不被捕获柱保留,而氨基酸被捕获柱保留。其后,保留有氨基酸的捕获柱被切换到分析流路中与分离柱相连,流动相将捕获柱中的氨基酸带入分析柱,这样,在排除了糖干扰的情况下完成分离,并用于胡罗卜汁样品中氨基酸的测定。D ing等[ 51 ]提出了离线除糖测定氨基酸的方法。
　　首先将样品中的糖通过氢型阳离子交换柱除去,然后测定氨基酸,并应用于果酒样品中氨基酸的测定,得到满意结果。与在线除糖方法相比,离线除糖方法的容量高,更适于含糖量高的样品中氨基酸的测定。用HPAEC2IPAD分离测定氨基酸时,精氨酸的保留时间很短,接近于死时间,这样影响了精氨酸的准确定量。为了增加精氨酸在阴离子交换柱中的保留时间, Jandik等[ 52 ]提出了通过阀切换方法将样品与硫酸同时进样,这样可利用阴离子交换柱中残存的阳离子交换基团增加精氨酸的保留。
　　此项技术已用于大豆水解液和细胞培养基样品的分析。高效阳离子交换色谱2积分脉冲安培检测法亦可用于氨基酸的分析。Jandik等[ 53 ]用此方法测定了血浆中的高半胱氨酸和甲硫氨酸,所用工作电极为铂,流动相为0. 15 mol/L高氯酸钠、0. 02 mol/L高氯酸和5%乙腈。用积分脉冲安培法检测氨基酸时,存在金工作电极污染问题,而且尚无有效的清洗方法。为克服金电极的污染, Cheng等[ 54 ]研制了“可抛弃”金电极,用此电极分析氨基酸的结果与普通金电极一致。高效阴离子交换色谱2积分脉冲安培法可用于蛋白质水解液、食品、饲料等样品中氨基酸的测定。常用的蛋白质水解方法可与之相匹配。3种色谱法分析氨基酸的比较见表3。

　　5其它分析技术
　　有许多关于毛细管电泳技术(CE)分析氨基酸的报道[ 55～57 ]。此方法适合于氨基酸的手性分离。两第3期于泓等:氨基酸分析方法的研究进展104种CE模式用于氨基酸的分析。一种是毛细管区域电泳( CZE) ,另一种是胶束电动毛细管色谱(MECC)。与HPLC相比, CE的优点是分离效率高,无须梯度洗脱,分析速度快,溶剂消耗少。然而, CE分析的重现性较差。Sm ith[ 58, 59 ]总结了CE分析氨基酸的进展。柱前、柱上和柱后衍生技术,紫外、荧光、电化学、质谱等检测技术,均被用于分析氨基酸。在柱前衍生RP2HPLC分析氨基酸中所用的衍生试剂多数亦适用于CE法。氨基酸存在手性异构体(D型氨基酸和L型氨基酸) , CE是目前用于氨基酸手性分离报道较多的方法。W an等[ 60 ]对CE用于氨基酸的手性分离做了详细评述。氨基酸的手性拆分主要分为直接拆分和间接拆分两种方式。直接拆分是在加入手性选择性试剂的背景电解质溶液中分离氨基酸对映体,手性选择性试剂主要有环糊精类化合物、抗生素和表面活性剂等。间接拆分是利用手性衍生试剂将手性氨基酸转变为具有不同化学性质的衍生物,即手性消除,然后在非手性条件下进行分离。随着CE技术的发展,其在氨基酸及其手性异构体分析方面将起重要作用。
　　气相色谱( GC)用于测定衍生的氨基酸已有较长时间[ 61 ]。此方法的优点是分离时间短、柱效高及易与质谱联用;缺点是衍生反应干扰多、专一性差。目前此方法在氨基酸分析中应用不多。Gehrke等[ 62 ]比较了气相色谱与柱后衍生高效阳离子交换色谱分析氨基酸,发现二者的结果是相近的。Husek等[ 63 ]报道了用GC同时分析血浆中的20种氨基酸和30种非氨基有机酸,样品制备时间不足30 m in。GC/MS是一种强有力的分析方法,可测定氨基酸异构体[ 64 ]。高效液相色谱/质谱(HPLC /MS)和毛细管电泳/质谱(CE /MS)分析氨基酸是一种新趋势。Schmeer等[ 65 ]用液相色谱/大气压离子化质谱(LC /AP I2 MS)测定了D /L 2胱氨酸和半胱氨酸的PTC衍生物,得到了17种PTC2氨基酸和6种PTC2胱(半胱)氨酸的碎片。Ma等[ 66 ]用LC /AP I2 MS测定了鼠脑中的谷氨酸和γ2氨基丁酸。Pramanik等[ 67 ]用热喷雾LC /MS分析了氨基酸的PTC衍生物。Kwon等[ 68 ]用高效液相色谱/大气压微波等离子体离子化质谱(HPLC /AP2 M IP I2 MS)测定了非衍生化氨基酸。Qu等[ 69 ]用离子对反相液相色谱/同位素稀释串联质谱测定了人血液中的非衍生化氨基酸。王宗义等[ 70 ]用液相色谱/电喷雾离子化质谱(LC /ESI2 MS)分离鉴定了碘化酪蛋白水解产物中的碘化氨基酸。He[ 71 ]、Soga[ 72 ]、Schultz[ 73 ]等用毛细管电泳/电喷雾离子化质谱(CE /ESI2 MS)分析了非衍生化氨基酸。

文章出自: 世科网

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