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藏药蕨麻多糖水解单糖的毛细管区带电泳分离研究 [复制链接]

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只看楼主倒序阅读使用道具楼主发表于: 2014-01-03

藏药蕨麻( Potent i l l a anserina L . ) 属青藏高原特有的经济植物,为蔷薇科委陵菜属植物鹅绒委陵菜之膨大块根,又叫“人参果”,属多年生草本植物。蕨麻作为一种具有较高营养价值和医疗保健功能的药食两用植物,有着广阔的开发应用前景[1 ] 。现代药理学表明:蕨麻具有健脾胃、收敛止血、补血益气、生津利痰之功效,主治脾虚腹泻、贫血及营养不良等症[223 ] 。另有报道蕨麻具有治疗黄疸性及病毒性肝炎的功效[425 ] ,是一种常用藏药及滋补佳品。据文献记载,蕨麻中含有糅质、糖类、蛋白质、脂肪酸及委陵菜苷等成分[ 629 ] ,而对蕨麻多糖的研究相对较少。杨桦等[ 10 ] 从蕨麻中分离出多糖,并测定了总糖含量。陈灵然
等[11 ] 和张霞等[12 ] 分别进行了蕨麻多糖的药理学活性研究。刘春兰等[13 ] 用苯酚2硫酸法对蕨麻多糖的单糖组成进行了分析,但由于方法选择性差,多数单糖组分无法检出。
毛细管电泳以快速、高效、灵敏度高、所需样品量少等优点被广泛应用[14215 ] 。目前,毛细管电泳对糖的分析主要集中在单糖和寡糖的分离检测。Suzuki 等[16 ] 提出了一种不同于还原氨化类型的衍生法,以12苯基232甲基252吡唑啉酮( PMP) 为衍生试剂,利用活泼碳(C24) 和还原糖的还原端之间的缩合反应进行糖类的测定。赵燕等[17 ] 以PMP 作为衍生试剂成功分离了八种单糖,并将该方法用于中药大黄多糖(RTP)的单糖组成及其摩尔比的测定。本文以12萘基232甲基252吡唑啉酮(NMP) 作柱前衍生剂,采用水提取乙醇逐级沉淀法从蕨麻中提取多糖组分,经Savage 法脱蛋白后的多糖以三氟乙酸水解,所得单糖用NMP标记后,采用毛细管区带电泳实现了各组分的分离和定量测定,为蕨麻多糖的开发应用提供了理论依据。
1 　实验部分
1. 1 　仪器、试剂与材料
HP23D 毛细管电泳仪(美国,Agilent 公司) ,配备二极管阵列检测器;58. 5 cm ×50μm i. d. 毛细管(有效长度50 cm ,河北省永年锐沣色谱器件有限公司) 。12萘基232甲基252吡唑啉酮(NMP) 由本实验室合成[18 ] ;单糖标准品(美国, Sigma 公司) ;硼砂(分析纯,徐州试剂二厂) ;其它试剂均为分析纯;水为Milli2Q 超纯水。
蕨麻植物样品购自西宁市药材市场,经中国科学院西北高原生物研究所藏药中心周昌范研究员鉴定。
1. 2 　标准溶液的配制
准确称取葡萄糖、半乳糖、甘露糖标准品各0. 0180 g ,阿拉伯糖、木糖各0. 0150 g ,鼠李糖、岩藻糖各0. 0164 g , 葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸各0. 0212 g ,用水溶解并定容至10 mL ,得到各单糖浓度均为0. 01mol/ L 的标准混合液。准确称取NMP 0. 112 g ,用乙腈定容至10 mL ,其浓度为0. 05 mol/ L 。
1. 3 　蕨麻多糖的提取
取干燥、研细的蕨麻根粉20 g ,加200 mL 去离子水,90 ℃下超声提取1 h ,抽滤,取上清液减压浓缩至刚好有固体颗粒析出,加3 倍体积的95 %的乙醇,静置24 h ,离心得沉淀物。所得沉淀物用60 mL 水溶解后,用氯仿2正丁醇(体积比4∶1) 萃取三次(脱蛋白) ;上清液加60 mL 乙醇放置24 h ,离心沉淀,所得沉淀物70 ℃烘干,得50 %乙醇沉淀的蕨麻粗多糖(P50) 170. 67 mg ;离心后的上清液补加80 mL 乙醇,放置24 h 后离心沉淀,沉淀物70 ℃烘干,得70 %乙醇沉淀的蕨麻粗多糖(P70) 18. 07 mg ;继续在所得的上清液中加400 mL 乙醇,放置24 h 后离心沉淀,所得沉淀物70 ℃烘干,得90 %乙醇沉淀的蕨麻粗多糖(P90) 9. 33 mg。
分别取上述三种蕨麻粗多糖5 mg ,加2 mol/ L 的三氟乙酸1 mL ,封口后于110 ℃下水解8 h 放冷后N2 吹干,用水溶解并定容至1 mL 备用。
1. 4 　单糖的衍生
向2 mL 安瓿瓶中加入200μL NMP 乙腈溶液、20μL 单糖标准品混合液、20μL 17 %氨水,封口后于70 ℃水浴中反应35 min , 取出放冷后用氮气吹干,加2 mL 乙腈2水(体积比为4∶1)溶解后进样分析。衍生化反应见图1 (以甘露糖为代表单糖) 。
1. 5 　分析方法
以不同浓度的硼砂缓冲溶液,在不同p H、电压和温度下,采用二极管阵列检测(DAD) 分别对糖类衍生物进行测定。实验前对缓冲溶液进行超声脱气5 min ,每次进样之前,分别用0. 1 mol/ L NaOH溶液、超纯水、硼酸盐缓冲液冲洗毛细管柱5 min ,更换缓冲液时,需要分别冲洗10 min 。
2 　结果与讨论
2. 1 　NMP 与PMP 紫外吸收
将NMP 与PMP 分别溶解在乙腈(ACN) 、甲醇(MeOH) 、乙醇( EtO H) 和四氢呋喃( THF) 中(浓度均为1. 0 ×10 - 5 mol/ L) ,在相同实验条件下测得的NMP 与PMP 的最大紫外吸收和摩尔吸光系数见表1 。NMP 是在PMP 的基础上用萘基取代苯基后的产物,萘基取代后的NMP 分子共轭体系加强,243 nm 波长处的摩尔吸光系数明显增加,检测灵敏度更高。
2. 2 　衍生化条件的选择
NMP 与糖的衍生随溶剂不同衍生化产率有显著差异。实验中分别选取ACN 、MeOH、THF 、N ,N2二甲基甲酰胺(DMF) 、二甲亚砜(DMSO) 作溶剂,对衍生产率进行了考察。结果表明,在DMF、DMSO 和ACN 中的衍生产率基本相同,均高于在MeO H 和THF 中的衍生产率。考虑到衍生液的后续处理,实验中选用ACN 作溶剂。NMP 与糖的衍生化随碱性催化剂的不同,导致不同的衍生化产率。林雪等[19 ] 改进了PMP 与单糖的衍生反应,用氨水代替NaOH作碱性催化剂,得到了满意的结果。本实验采用17 %氨水作为催化剂,可得到与NaOH作催化剂相同的效果,且反应产物可直接用氮气吹干,从而简化了衍生液的后续处理。衍生化产率随温度升高而提高, 超过70 ℃后衍生产率随之降低, 实验中选择衍生化温度为70 ℃, 衍生化时间35 min 。对衍生试剂用量的考察结果表明, 衍生试剂对总糖用量的摩尔数比达5 倍以上衍生产率恒定, 实验选取衍生试剂用量为总糖量的5 倍。
2. 3 　毛细管电泳分离条件优化
本研究考察了碳酸盐缓冲体系、磷酸盐缓冲体系和硼酸盐缓冲体系后,发现硼酸盐缓冲体系对糖类衍生物的分离效果最好。缓冲溶液浓度的改变会造成电导的变化,从而引起峰形的前伸和拖尾,所以,选择合适的硼酸盐浓度对提高分离效果具有很重要的作用。实验在固定其它条件的前提下考察了硼酸盐浓度在40～65 mmol/ L 范围内对糖类衍生物分离的影响,发现硼酸盐浓度为55 mmol/ L 时分离效率较高,迁移时间较短。
溶液p H 的改变会影响溶质的迁移行为和引起电渗流的变化[20 ] ,从而影响分离。考察了不同p H 的缓冲溶液对分离的影响,发现p H = 9. 46 时分离效率最高,分离时间最短,分离度较高。温度和电压对糖类分离影响较小,为了防止温度过高或电压较高引起温度过高产生较大的焦耳热影响分离效果,实验选择温度为20 ℃,电压22 kV。单糖标准品衍生物的分离度、迁移时间、理论塔板数和选择性见表2
2. 4 　重现性、线性回归方程和检出限
在相同毛细管电泳分离条件下,对100μmol/ L 糖类衍生物进行6 次平行分析, 保留时间和峰面积重复性见表2 , 迁移时间相对标准偏差(RSD) 小于0. 48 % , 峰面积的RSD 小于4. 8 %。在最优化条件下,在250～5μmol/ L 的范围内,依据峰面积对单糖浓度进行线性回归, 所得各单糖衍生物的线性回归方程、相关系数和检出限见表3 。各单糖衍生物的线性相关系数在0. 9980～0. 9998 之间, 检出限(S/ N = 3) 在0. 85～2. 19μmol/ L 之间。
2. 5 　回收率
在蕨麻多糖水解液中分别加入10μL 浓度为1. 0 ×10 - 2 mol/ L 的单糖标准溶液, 按照上述方法进行衍生, 重复3 次所得的各单糖的回收率在94. 83 %～104. 8 %。
2. 6 　样品测定
取1. 3 节中多糖水解液40μL 于2 mL 安焙瓶中,依次加入NMP 溶液150μL ,17 %氨水30μL ,封口后于70 ℃水浴衍生35 min ,冷却后N2 吹干后,加水100μL 和乙腈400μL 溶解后进样分析。蕨麻多糖水解单糖电泳分离见图2 。经多次测量得单糖含量见表4 。
3 　结论
采用NMP 作为柱前衍生试剂,通过对衍生化条件和毛细管区带电泳分离条件的优化,建立了灵敏、快速测定单糖的方法。实验表明,藏药蕨麻中含有九种单糖,其中以阿拉伯糖(Ara) 、半乳糖( Gal) 和半乳糖醛酸( GlcUA) 含量最高,葡萄糖( Glc) 、鼠李糖(Rha) 、葡萄糖醛酸( GlcUA) 含量居中,木糖(Xyl) 、甘露糖(Man) 、岩藻糖(Fuc) 含量相对较低,该方法可作为藏药蕨麻中单糖组成测定的常规方法。本方法在藏药蕨麻多糖测定中的成功应用,将为丰富植物资源的多糖药物组成分析和质量控制提供新的研究方法。