测方法 fEdQR-> dZRz'd 1.实验部分: 6z"fBF 1.1材料、试剂 `|i #) Cleanert PEP吡咯烷酮化聚苯乙烯/二乙烯基苯固相萃取柱(100mg/6mL, P/N: PE1006,博纳艾杰尔科技);Cleanert Silica CM改性硅胶固相萃取柱 ( 1000mg/6mL , P/N : CM0006,博纳艾杰尔科技)
-[v:1\Vv 液相色谱柱 (Halo C18 , 2.1×100mm, 2.7μm, P/N: 92812-602,博纳艾杰尔科技)
:N%cIxrqP 标准品:雌酮(CAS.No. 53-16-7)、雌二醇(CAS.No. 50-28-2)、醋酸甲地孕酮(CAS.No. 595-33-5)、醋酸氯地孕酮 (CAS.No. 302-22-7 ),购自
中国药品生物制品检定所。
^DVr>u 1.2样品前处理方法 ?};}#%971 1.2.1 Cleanert PEP样品提取净化法
SMk{159q& 提取:取2g奶粉,加标,然后加12mL 80% 乙腈,涡旋混匀两分钟后,离心(90000r/min, 6min)取3mL上清液,加入9mL超纯水稀释,涡旋混匀后,待过Cleanert PEP柱净化。
()K%Rn 净化步骤:
#18H
Z4N 1) 活化:以5mL乙腈,5mL水活化Cleanrt PEP;
9">}@1k 2) 上样:把上述稀释后的样品溶液过柱,流速控制以1mL/min为宜;
42:\1B#[ 3) 淋洗:待样品溶液完全通过小柱后,用5mL 5%乙腈淋洗小柱,然后真空抽干3min;
rZe"*$e 4) 洗脱:以3-5mL乙腈洗脱目标,收集流出液;
Q<d\K(<3?: 5) 浓缩:收集液以氮气浓度吹干(40℃水浴),后以50% 甲醇水定容至1mL,混匀后过0.22μm微孔滤膜过,进LC-MS/MS分析。
Us M|OH5k 1.2.2 Cleanert Silica样品提取净化法 ]OM|Oo
提取:取2g奶粉,加标,然后加12mL 乙腈,涡旋混匀两分钟后,离心(90000r/min, 6min)取3mL上清液,待过Cleanert Silica柱净化。
$B*E k>EK 净化步骤:
LCRreIIgZ 1) 活化:以5mL乙腈活化Cleanrt Silica小柱;
FsY}mql 2) 上样:把上述提取液过柱,收集流出液;
3otia;&B
3) 淋洗:以5mL乙腈洗涤小柱,收集流出液;
EkEM|<GNd 4) 浓缩:合并以上流出液液,以氮气浓度吹干(40℃水浴),后以50% 甲醇水定容至1mL混匀后过0.22μm微孔滤膜,进LC-MS/MS分析。
22`W*e@6h 1.3 LC-MS/MS检测条件
"Q
A# 1.3.1 孕激素(醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮)测定 $f*N 液相色谱条件:色谱柱 (Halo C18, 2.1×100mm, 2.7μm);流动相:A:0.1%甲酸水,B: 甲醇,梯度条件(略);流速:0.3mL/min,柱温:40℃,进样量:10μL
={W;8BUV%^ 参考质谱条件:电离源:电喷雾正离子模式;其他(略)
?2%
d;tW 1.3.2 雌激素(雌二醇、雌酮)测定 m-dne/%_ 液相色谱条件:色谱柱(Halo C18 2.1×100mm,2.7μm);流动相:A:水,B: 乙腈,梯度条件(略);流速:0.3mL/min,柱温:40℃, 进样量:10μL
4VSlgoz 参考质谱条件:电离源:电喷雾负离子模式;其他(略)
j =r`[Bm 2.结果与讨论: X7?p$!M6;B 结果见图1、图2。用Cleanert PEP (反相)或Cleanert Silica CM(正相) 两种净化手段均可到达满意的回收率和净化效果,添加浓度在25ppb时回收率可达到80% 。
d47b&.v8e 用Halo色谱柱可以实现样品的快速分离,大大提高工作效率。
J i :2P* 雌二醇和雌酮两种激素,质谱相应偏低,质谱条件需要进一步优化。
nY'0*:'u dZIAotHN: 本实验结果采用单点定量判定,结果可能有失偏颇,详细数据需做基质添加标准曲线确证,方法的精密度,稳定性等亦需要进一步确证。
图1 两种孕激素总离子流图和选择离子流图(标品)
图2 两种雌激素总离子流图和选择离子流图(奶粉样品)