1、纯化的一般目标和方法 d7kE}{, z h2<!MH 首先，自然来源或者重组表达的
蛋白质经过一些粗提的步骤(例如：匀浆、离心、硫酸铵沉淀等)成为稳定的可以用于色谱分离的样品。
|6Y:W$7k =u2~=t=LV 然后进行捕获色谱(capture chromatography)，主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的杂质，此步最关心的是流速和载量，常采用高载量、快流速凝胶。
\Hp!NbnF$ ]izHn; + 经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱(intermediate chromatography)，目的是去除较难去除的杂质，此步最关心的是分辨率，常采用高分辨率的细颗粒凝胶。
6{5T^^x?< .h
<=C&Yg 最后为了得到符合
要求的最终
产品，去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者降解片断，进行精制色谱(polishing chromatography)，常采用具有高分辨率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。
q%G[tXw O.FTToh < 2、纯化前的准备工作 m u9,vH <zqIq9}r (1)样品稳定性试验a、测定样品在pH 2-9的稳定性；b、测定样品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸铵中的稳定性；c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性；d、测定样品在4-40℃的稳定性；e、室温下静置过夜，测定对蛋白水解酶的稳定性。
6|p8_[
e` X}'rPz\Lu (2)样品预处理a、去除样品中颗粒物(0.45-0.22微米膜过滤或者10000 g离心15分钟)
M%:\ r y4: 0dwD ?GG2 b、去除样品中脂类( 10000 g离心15分钟或有机溶剂抽提)
N|mggz o%Q9]=%! c、去除样品中核酸(加入核酸酶消化或者使核酸沉淀)
(A2ga):Pk <q'?[aKvR d、抑制样品中蛋白水解酶(加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第一步分离或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白)
r } Wdj <!t;[ie?y (3)样品的保存条件：短期储存(小于24小时)
"
:e
<a? I 8i|tQz a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀b、在密闭容器中冰箱冷藏较长期储存(数天)
WS&a9!3; L2Cb/!z`c a、b、同上c、加入适当的抑菌剂长期储存a、同上b、冰冻或者最好冻干(真空冷冻干燥)保存。
BT(eU*m- KYkS ^v 3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立 _H U>T Z wKX$(n a、目的蛋白含量测定酶活性测定、
生物活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。
!|9@f$Jv 6GAEQ] b、总蛋白含量测定紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法(考马斯亮兰G-250)等。
>G1]#'6; X r o5 ~G c、样品复杂度
检测HPLC(离子交换、凝胶过滤、反相)、SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳(CE)。
UH &1QV 9[~.{{Y
~d<&OL 4、蛋白质的来源 j<WsFVS 8fQfu'LyjY (1)天然蛋白： 天然产物中的目的蛋白一般含量很少而且组分极复杂，在分离过程中须采用多步骤才能去除各种杂质，并应在整个过程中降低蛋白水解酶的活性。
iqoMQ7% 18~jUYMV (2)重组蛋白： 重组蛋白则目标蛋白的丰度较高。重组蛋白主要有三种表达定位：
1e9~):C~W /V/ )A\g a、细胞质：在种情况下，必须破坏细胞结构才能得到目的蛋白质，同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放；在表达量较高的条件下，一般形成包涵体，包涵体含有过表达目的蛋白，且容易通过高速离心分离，但是包涵体的溶解与复性是较复杂的。
r0f&n;0U4 WOgkv(5
KN b、外周质： 表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间，这样目的蛋白可以较少地受到蛋白酶的
作用并减少了宿主蛋白的
污染。
>C{8}Lg-. ( ?e
Et& c、分泌到培养基：这种表达一般蛋白质浓度较低，主要受到培养基中的污染。
\ %xk u:
微博帐号登录
内容互通，快速登录
QQ帐号登录
