化学药 含量测定分析方法验证的可接受标准简介，审评四部，黄晓龙，20060120) #1\` !7TO3
含量测定分析方法验证总结 frW\!r{LT
1、准确度（加样回收实验） Jr;w>8B),
该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。 8-7Ml 3G*
可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%。 UF6U5],`u
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中药一般情况下加样回收率在95%~105%，RSD要求：TLCS＜5%，HPLC或GC＜3% 。 <YEKbnw$o
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回收率实验是为了考察选择的提取方法或检测方法能否将样品中的待测成分完全检测出来。 lxgfi@@+h
具体操作：05版药典前，大多是取一半样品加入一半的标准品，平行做6份；按05版药典方法学验证要求，改为先取一定量已知含量的样品9份（也是常规供试品溶液的一半量），然后分别加入相当于取样量80％，100％，120％的对照品，使二者之和仍与原常规供试品溶液的含量相近，这样可以保证加样供试溶液的浓度在落在线性范围内。 !\d~9H%`B
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与西药的区别：因为中药样品没办法做相同样品基质的空白对照，只能在试样中加入已知浓度的溶液，然后计算增加量的回收率。而化学药通常做法是：取一半处方量的80％，100％，120％的空白辅料量，加入相当量的原料。各浓度下的平均回收率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%。 %3TioM[B
2．线性 <oT1& C{
线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为：在80％至120％的浓度范围内配制5份浓度不同的供试液，分别测定其主峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.998，Y轴截距应在100％响应值的2％以内，响应因子的相对标准差应不大于2.0%。 x0{B7/FN
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①a在公式中是个斜率，它越大，说明这个方法的灵敏度越高，说明白一点，既样品量稍微有点变化，峰面积就有很大变化，对微积分学的比较好的人对此应该理解的比较深刻。b应该是越小越好，b其实就是实验误差的结果，理论上，完全浓度为0时峰面积就应该是零，但误差造成了b，不能成为零，所以说b越小越好。有一种方法就是在你自己实验数据的基础上把0，0也作为一个点进行回归，强制过零点 'm |T"Ym~
Ａ和Ｂ的数值使用的响应值（如ＨＰＬＣ法中的峰面积）大小有关，例如：同样浓度的黄芩苷对照品，Ｗａｔｅｒｓ的ＨＰＬＣ仪积分面积一般都是几十万或几百万，而在Ａｇｉｌｌｅｎｔ１１００上的锋面积就只有几百到几千，这样一来各自的回归曲线的Ａ，Ｂ数值大小就不同．Ｂ的正负，只是说截距在原点的上方或是下方，在实际标准曲线中，正负都会遇到的． )p;t
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②一般的要求是：要求Ｒ＞０.９９，Ｂ＜１００％响应值的２％（如采用浓度由低到高分别为Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，Ｃ４，Ｃ５五个浓度点作标准曲线，其中Ｃ３为中间浓度（即１００％响应值），其对应的峰面积为Ａ３，则Ｂ＜２％Ａ３ -Q5UT=^
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③一般遵守截距与斜率至少差两个数量级才有效。 BQ[R)o
y=ax+b，如果a〉100倍b，可以用外标一点法；a<100b，用外标两点法 )=#Js<&3:
采用外标一点法的前提是,忽略截距,对测量结果造成的误差小于1%,因此截距与斜率的比值并没有具体规定,只要在你的线性范围内,忽略截距造成的误差符合规定就可以,可以利用线性中最小浓度代入公式,计算有和没有截距是的值,看其误差有多大就可以了 o+ {i26%
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④作标准曲线时（无论你是内标法、还是外标法都是如此的），只需要作一份对照品就可以了（当然，一般测定含量都用两份对照品，这样还可以避免对照品称量的误差）。 e ]; IQ
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⑤响应因子的相对标准差应不大于2.0% ,|?#+O{
响应因子＝峰面积/浓度 校正因子＝浓度/峰面积 Pj g#
一般液相用外标法进行定量，是采用两点做标准曲线，取两点的平均响应因子，计算其相对标准偏差，不得大于2 9{S$%D
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3．精密度 ^b$G.h{o!E
精密度有三种内容：重复性、中间精密度和重现性，我们一般必须做重复性，可以做中间精密度，不需做重现性。 UL&>
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1、仪器的精密：指同一样品溶液连续进样6-9次所得结果，对照或样品均可； rAW7Zp~KK
2、重复性：在相同的条件下，由一人取同一均匀样品，平行测定所得的结果； i88`W&tI{
3、中间精密度：不同时间或不同人员或用不同设备测定同一均匀样品，所得的结果； Wie0r@5
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4、重现性：类似药检所复核，但我认为也是必须要做的。如果申报材料时不做，你怎么知道方法是否能重现呢，万一重现不出来，不是晚了吗。 l$l6,OzS@
5、稳定性：主要是考察溶液放置时间的稳定性，故只做供试液即可；精密度主要考察检验仪器的稳定性；重复性是考察方法的稳定性，它包含从样品处理到仪器检测的全过程密度跟重复性是不一样的 g3%x"SlIU
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1）.联系 3qNuv ];2
精密度包括重复性，另外还有中间精密度、重现性。 B"*P BJuOA
2）.区别 r"x}=# b!
精密度 指在规定的测试条件下，同一均匀供试品，经多次取样进行一系列检测所得的结果之间的接近程度（离散程度）。 7Ot&] M
重现性 指在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度。 b1=! "Y@
可以看看精密度试验的目的，我们只作只作供试品的，从来没有因为这个药审中心给发补，我觉得可以说明问题。 OMYbCy
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说说我的中间精密度设计：我是取三批供试品在不同时间，用不同的试验仪器，同一个试验人（因为若不同试验人，原是记录也是要两个人写，很麻烦，方法规定是三个变量中的任意变动，所以我认为不必三个变量都改变，这里我只改变时间和仪器）测定两次，分别为中间精密度1和中间精密度2，我将其中一次测定结果作为零天三批测定值。 >%t5j?p
还有人的做法是不做三批，只作一批。 P{2ED1T\
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1）重复性 N#:W#C{16w
配制6份相同浓度或分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于2.0%。 &&96kg3
重复性测定可在规定范围内，至少用9 次测定结果进行评价，如制备3 个不同浓度的样品，各测定3 次，或采用同一批样品（把被测物浓度当作100％），用至少测定6 次的结果进行评价。 3|/zlKZz
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2）中间精密度 f+QDjJ?z
配制6份相同浓度的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于2.0%。 %b ^.Gw\L
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①中间精密度在同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度。 CX>QP&Gj
重现性实验是否在申报新药时要做，药典会的人明确说不要做，因为在药检所复核你的质量标准时就做了重现性，因此在申报时不需要做。 uup>WW
重复性（repeatability）与重现性（再现性，reproducibility），二者都是用来评价分析结果的精密度。大多数人都不作严格区分，有的文献中还常常混用。但是二者的实际意义是不一样的。 &[-b #&y
重复性是指同一分析人员在同一条件下所得分析结果的精密度，重现性是指不同分析人员或不同实验室在各自的条件下所得分析结果的精密度。也就是说，重现性比重复性提出了更高的要求。重复性好，重现性未必好。而重现性好，重复性肯定好。二者都是用多次分析结果的RSD来表示。 9M .cTIO{
对现代仪器分析而言，重复性是容易实现的，而重现性是更重要的，也是方法验证必须考察的。 <\5E{/7Tl
方法的重现性包括连续多次进样分析的重复性、不同天数间的重复性、不同型号仪器间的重现性和不同实验室间的重现性。 _R|8_#yM
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②方法开发人员，首先应测定重复性。即在相同条件下连续进样5－10次，一般要求保留时间的RSD不大于1%，峰面积的RSD不大于5%。 os`#: Ao5
如果样品要经过预处理，还应测同一样品多次处理的重复性。即同一样品取3－5份作平行处理，测定结果的RSD不应大于5%。某些工业分析要求不大于10%。至于天与天之间的重复性也不应大于10%。 K<D=QweOon
当上述重复性满足要求后，说明该方法在你的实验室是可靠的。要将此方法推广使用，还必须测定不同仪器、不同分析人员、不同实验室之间的重现性。当这些重现性都能满足要求时，这一方法的的可靠性就得到较为满意的验证。 Hd0? }w \
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