荧光定量PCR实验指南 [复制链接]

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7、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析； <!h&h  
目前市场上有许多种实时PCR仪：其中包括ABI7700，ABI7900，ABI7000 (Alied Biosystems)；MX4000 (Stratagene)；iCycler (Bio-Rad)；Smartcycler(Cepheid)；Robocycler (MJ Research)；Lightcycler (Roche)；ROTORGENE(CORBERT) ；杭州博日（Linegene）。 <tZPS`c'_  
不同的仪器使用方法有所区别，但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG（hot start）和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。 s}Q%]W  
为确保实验数据的有效性，每次实验都设阴性对照和4个标准品，每个样品都平行做2个复孔。 CCJ!;d;&87  
基线或阀值的设定 通常是以10－15个循环的荧光值作为阀值，也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。 Z7&Bn  
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8、疑难解答 ;ti{ #(Ux  
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问 题	可能原因	建议解决方法
G0Wzx)3]   定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量	>a98H4   DNA模板质量不好，含有抑制剂	,,r%Y&:`6   提高模板质量，诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA
5gWn{[[e)y   PCR引物设计较差	Zg%SE'kK   避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
ANh5 -8y   探针设计较差	EAq/Yw2$   对探针序列进行blast比对，设计符合要求的探针
V|vU17Cgy   PCR引物合成较差	5EDM?G   用普通电泳法，看引物的设计和合成质量，是否有目的条带出现。
M?5[#0"&V   荧光探针无功能	j3F[C:-zY   确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 8}m]XO   用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 ['m@RJm+   必要的话设计和合成探针。
&;7\/m*W1   模板浓度太低	6sl*Ko[   使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。
]J)WcM:   镁离子浓度太低	=!r9;L,?   从3mM到5mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。
,dKcxp~[   引物浓度太低	f+Nq?GvwBQ   最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。（见公式1）
]c8lZO>   选择优质酶进行扩增	+r9:n(VP   选择hot start Taq酶进行扩增，可提高灵敏度，增加产量，降低干扰因素
D %~s   退火温度太高	P5Ms X~mT   使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。
YSk,kU   反应物中有不明物干扰	IZe Wswz   在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰，对任何实验样品或试剂，均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。
qR!SwG44+   定量PCR阳性对照无扩增曲线（针对：已经优化好的体系）	-uN5DJSW   引物、探针设计合格；原来合成质量已经验证。需确认：	$+zev$f   反应成分是否漏加；确定反应条件是否合适； )Z0pU \   正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题； k61Ot3   确认体系：1、引物是否降解（看扩增产物是否可电泳出）来判断引物和酶功能；2、探针是否降解（用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强）。
fLAOA9   仪器是否正常工作	TIlcdpwXf
K[PIw}V$?:   定量PCR阴性对照一直有扩增曲线	WMZ&LlB%   模板或PCR残余污染	)nJs9}( 0   隔离污染来源，更换试剂。 = l&7~   使用UNG/dUTP防污染系统。 !.H< dQS   使用专用的精致移液器。 DY'D]*'7$   在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。
PYPs64kNC]   体系有问题	?V"X=B2   酶浓度不对，Mg离子浓度不对
q>X#Aaib   定量PCR（染料法）出现非特异信号	A#RA;Dt:   引物二聚体多	Zm!T4pL   检查引物设计和合成环节，必要时更改引物
*KN'0Z@W   更换热启动酶	.&=nP?ZPC6   热启动酶能增加反应的特异性，提高灵敏度
Y` Oz\ W   设定检测信号时的温度	CWdA8)n.   在更高的温度下检测荧光信号（此时引物二聚体已经解链）
f1y3l1/   定量RT-PCR R$k4}p   无扩增产量 >VM@9Cph   相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照	W2P(!q>r]   无cDNA合成	:{bvCos<)
c+,F)i^`   cDNA合成温度太高	AX,V* s   降低保温温度
CtJ*:wF   反转录cDNA产物被二级结构封闭	yaza   提高保温温度。重新设计引物
{z>fe }   RNA被损害或降解	uP2e/a   必要的话更换RNA
]=!wMn**   RNAse污染	88x_}M^Fnl   维持无菌条件；加入RNase抑制剂
#{KYsDtvx   荧光探针无功能	Cl#PYB{1Y   确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 S^(OjS   用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 >>/|Q:   必要的话设计和合成探针。
sh;DCd   灵敏度低 ~SUrbRaY>   须在比预期更高的循环中检出产物（Ct滞后）	3'tcEFkH   初始模板RNA不充分	U[7 &    增加模板RNA的浓度；使用10ng-1µg的总RNA
q_iPWmf p*   RNA被损害和降解	XzLB#0   必要的话更换RNA
:jL>sGvBv   RNAse污染	R 6JHR d   维持无菌条件；加入RNase抑制剂
(Yi1U~{:   无效的cDNA	$fifx>!   通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
K(jo[S   无效的PCR扩增	(U@Ks )   注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。 RZMR2fP%   调整cDNA合成温度或引物设计
4 # +i\H`   检测使用仪器	EKu%I~eM   扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查，是整体滞后还是个别孔滞后
|k.%e4   PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误	tzIcR #Z   采用荧光探针法	/EP Rg RX   增加结果特异性和产物的忠实性
8MQb5( !   循环数太多	N 2XL5<   降低循环数。
76oJCNY   四种dNTP的浓度不同	X!x mto   制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。

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其他问题： FJDC^@Ne  
1）、文献上找到的引物和探针序列能否直接使用？ ^7wqb'xg  
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通常国外的文献可信度比较高，可直接使用；但为了保险起见，最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证；或者再进一步用primer软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析，这样更有利于您对整个实验的把握。 l>K
+4  
2）、在实验之前要进行哪些准备工作？ ':fp|m)M  
首先要不加探针做常规的PCR实验，验证引物是否工作、模板是否降解、模板纯度是否合适，可以采用《通用PCR Master Mix 试剂盒》来缩短该过程。 {7jim  
3）、标本的采集和处理应该注意什么问题？ $*942. =Q  
根据实验要求和目的，有针对性采集病灶部位的标本；采集好的标本，最好根据每次实验用量，用冻存管分成几小份，放在－80℃保存，以免反复冻融；标本通常分成3类，如细胞组织、分泌物、血清全血；如果是血清，不能有融血现象的发生，否则会影响PCR的扩增；如果是全血，最好不用EDTA作为抗凝剂，选用柠檬酸作为抗凝剂，否则会影响PCR的扩增；如果是组织，最好用蛋白酶K消化；如果是提RNA的标本，更应该防止反复冻融和保持标本的新鲜。 Nna.NU1  
4）、在做荧光定量实验时要注意些什么呢？ *0xL(  
见产品操作注意事项。 LWv<mtuYf  
5）、如果出现污染该怎么办？ Tk?uJIS :  
以替换法确定污染从何而来，对症下药，值得注意的是，因荧光定量PCR的敏感度极高，从防止污染的角度出发，最好在体系中加有dUTP，一旦出现污染现象，可以用UNG酶消除；同时将实验室分成4个区，即试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制、扩增和产物分析区。