荧光定量PCR实验指南 [复制链接]

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7、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析； |_8-3  
目前市场上有许多种实时PCR仪：其中包括ABI7700，ABI7900，ABI7000 (Alied Biosystems)；MX4000 (Stratagene)；iCycler (Bio-Rad)；Smartcycler(Cepheid)；Robocycler (MJ Research)；Lightcycler (Roche)；ROTORGENE(CORBERT) ；杭州博日（Linegene）。 KD *,u{v;  
不同的仪器使用方法有所区别，但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG（hot start）和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。 &Jv j@,>$d  
为确保实验数据的有效性，每次实验都设阴性对照和4个标准品，每个样品都平行做2个复孔。 9 W><m[O  
基线或阀值的设定 通常是以10－15个循环的荧光值作为阀值，也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。 f@+[
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8、疑难解答 f@Rn&&-  
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问 题	可能原因	建议解决方法
hV])\t=yf   定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量	7OG=LF*V-   DNA模板质量不好，含有抑制剂	#.UooFk+Y   提高模板质量，诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA
cHs@1R/-s   PCR引物设计较差	\@vR*E   避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
RxY ;'NY   探针设计较差	/<vbv   对探针序列进行blast比对，设计符合要求的探针
r 4k=i 4   PCR引物合成较差	R:P'QM    用普通电泳法，看引物的设计和合成质量，是否有目的条带出现。
{$)zC*l   荧光探针无功能	lcH wKd   确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 ;BUJ5   用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 &duWV6Acw   必要的话设计和合成探针。
~UX@%0%)N   模板浓度太低	n]?Yv E   使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。
im|( 4f   镁离子浓度太低	T_|%nF-+   从3mM到5mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。
zD:"O4ZM^^   引物浓度太低	C']TO/2q   最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。（见公式1）
O|=5+X   选择优质酶进行扩增	Ppi/`X   选择hot start Taq酶进行扩增，可提高灵敏度，增加产量，降低干扰因素
B:#5U85m   退火温度太高	v=e`e68U~   使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。
UjxEbk5>^   反应物中有不明物干扰	Osncl5PD)   在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰，对任何实验样品或试剂，均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。
4$.$j=Ct."   定量PCR阳性对照无扩增曲线（针对：已经优化好的体系）	1$T;u~vg   引物、探针设计合格；原来合成质量已经验证。需确认：	(T:OZmEO.   反应成分是否漏加；确定反应条件是否合适； JoeU J3N   正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题； \^a(B{    确认体系：1、引物是否降解（看扩增产物是否可电泳出）来判断引物和酶功能；2、探针是否降解（用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强）。
jN 9|q   仪器是否正常工作	7Mq4$|qhD
6/_] |4t   定量PCR阴性对照一直有扩增曲线	4Gz5Ju   模板或PCR残余污染	1{D_30sG.   隔离污染来源，更换试剂。 ,p2BB"^_i   使用UNG/dUTP防污染系统。 QcQ QQM   使用专用的精致移液器。 !kCMw%[   在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。
/]7FX"   体系有问题	y.,S}7l:   酶浓度不对，Mg离子浓度不对
T,N"8N{K"   定量PCR（染料法）出现非特异信号	[O~'\Q   引物二聚体多	;VM',40   检查引物设计和合成环节，必要时更改引物
mBW E^   更换热启动酶	~q0g7?}&   热启动酶能增加反应的特异性，提高灵敏度
%f??O|O3   设定检测信号时的温度	xX;@ BS   在更高的温度下检测荧光信号（此时引物二聚体已经解链）
rb 8c^u#r   定量RT-PCR Twqkd8[   无扩增产量 V e/"9?Y_   相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照	tF:'Y ~3 p   无cDNA合成	D2hEI2S
}m '= _ u   cDNA合成温度太高	#bRr|`   降低保温温度
Z)iRc$;   反转录cDNA产物被二级结构封闭	2kv%k3Q{   提高保温温度。重新设计引物
$#Mew:J   RNA被损害或降解	Zmx[u_NG   必要的话更换RNA
Y-8qAF?SJ]   RNAse污染	wLa^pI4p ^   维持无菌条件；加入RNase抑制剂
g4n&k   荧光探针无功能	#3uBq(-Z   确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 iU)-YFO   用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 Y~RZf /`   必要的话设计和合成探针。
$}[Tj0+:   灵敏度低 zs+[Aco)   须在比预期更高的循环中检出产物（Ct滞后）	0 O{Y Vk`   初始模板RNA不充分	d2H&@80   增加模板RNA的浓度；使用10ng-1µg的总RNA
eYL7 G-3   RNA被损害和降解	wf7<#jIq   必要的话更换RNA
vFfvvRda4x   RNAse污染	Pn{yk`6E   维持无菌条件；加入RNase抑制剂
kndP?#> p1   无效的cDNA	M/U$x /3K   通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
h;vD"!gP   无效的PCR扩增	_/[n/"gn   注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。 ?KxI|os   调整cDNA合成温度或引物设计
ixJUqo   检测使用仪器	,2>:h"^   扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查，是整体滞后还是个别孔滞后
~A0E4UJgq   PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误	3)f=Z2U>   采用荧光探针法	X$JO<@x   增加结果特异性和产物的忠实性
!DnG)4#   循环数太多	oB[3? e   降低循环数。
XA])< dZ   四种dNTP的浓度不同	Y51XpcXQ   制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。

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其他问题： ?C{N0?[P-  
1）、文献上找到的引物和探针序列能否直接使用？ `ouzeu9}  
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通常国外的文献可信度比较高，可直接使用；但为了保险起见，最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证；或者再进一步用primer软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析，这样更有利于您对整个实验的把握。 FHC7\#p/9Z  
2）、在实验之前要进行哪些准备工作？ N-|Jj?c  
首先要不加探针做常规的PCR实验，验证引物是否工作、模板是否降解、模板纯度是否合适，可以采用《通用PCR Master Mix 试剂盒》来缩短该过程。 mTg
n}rXk  
3）、标本的采集和处理应该注意什么问题？ `y#C%9#  
根据实验要求和目的，有针对性采集病灶部位的标本；采集好的标本，最好根据每次实验用量，用冻存管分成几小份，放在－80℃保存，以免反复冻融；标本通常分成3类，如细胞组织、分泌物、血清全血；如果是血清，不能有融血现象的发生，否则会影响PCR的扩增；如果是全血，最好不用EDTA作为抗凝剂，选用柠檬酸作为抗凝剂，否则会影响PCR的扩增；如果是组织，最好用蛋白酶K消化；如果是提RNA的标本，更应该防止反复冻融和保持标本的新鲜。 >KFJ1}b|3  
4）、在做荧光定量实验时要注意些什么呢？ SAJ=)h~  
见产品操作注意事项。 :JIPF=]fc  
5）、如果出现污染该怎么办？ 7A6sSfPUy  
以替换法确定污染从何而来，对症下药，值得注意的是，因荧光定量PCR的敏感度极高，从防止污染的角度出发，最好在体系中加有dUTP，一旦出现污染现象，可以用UNG酶消除；同时将实验室分成4个区，即试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制、扩增和产物分析区。