荧光定量PCR实验指南 [复制链接]

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7、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析； |e&hm ~R1  
目前市场上有许多种实时PCR仪：其中包括ABI7700，ABI7900，ABI7000 (Alied Biosystems)；MX4000 (Stratagene)；iCycler (Bio-Rad)；Smartcycler(Cepheid)；Robocycler (MJ Research)；Lightcycler (Roche)；ROTORGENE(CORBERT) ；杭州博日（Linegene）。 M[=sQnnSFW  
不同的仪器使用方法有所区别，但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG（hot start）和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。 4e|(= W`  
为确保实验数据的有效性，每次实验都设阴性对照和4个标准品，每个样品都平行做2个复孔。 !wjD6NK  
基线或阀值的设定 通常是以10－15个循环的荧光值作为阀值，也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。 #X<s_.7DJ  
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8、疑难解答 f87lm*wZ  
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问 题	可能原因	建议解决方法
2{-'`lfM%   定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量	#_fL[j&   DNA模板质量不好，含有抑制剂	x):h|/B   提高模板质量，诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA
0hju@&Aa   PCR引物设计较差	KrD?Z2x   避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
Bf6\KI<V2   探针设计较差	4kf8Am(   对探针序列进行blast比对，设计符合要求的探针
Y[alOJ   PCR引物合成较差	5!d'RBO    用普通电泳法，看引物的设计和合成质量，是否有目的条带出现。
o[K,(   荧光探针无功能	kT4Tb%7KM   确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 \@:mq]Y   用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 AU^ 5N3%j   必要的话设计和合成探针。
vBjrI*0   模板浓度太低	*`wgqin   使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。
G>c:+`KS   镁离子浓度太低	l)( 3]   从3mM到5mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。
nJ~5ICyd   引物浓度太低	p v*n.U6   最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。（见公式1）
G^/8lIj   选择优质酶进行扩增	4z>SI\Ss   选择hot start Taq酶进行扩增，可提高灵敏度，增加产量，降低干扰因素
Q!G^CG   退火温度太高	vmK`QPu2   使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。
+yo1&b R/   反应物中有不明物干扰	\ J,pV   在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰，对任何实验样品或试剂，均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。
]<IK0   定量PCR阳性对照无扩增曲线（针对：已经优化好的体系）	rRzc"W}K+   引物、探针设计合格；原来合成质量已经验证。需确认：	ky-9I<Z,,   反应成分是否漏加；确定反应条件是否合适； xC+TO   正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题； *3]_Huw<   确认体系：1、引物是否降解（看扩增产物是否可电泳出）来判断引物和酶功能；2、探针是否降解（用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强）。
Doc_rQYku   仪器是否正常工作	$c<NEt_\
\RDS~u\d   定量PCR阴性对照一直有扩增曲线	!omf>CW;ud   模板或PCR残余污染	 d| OEZx   隔离污染来源，更换试剂。 u</LgOP`-   使用UNG/dUTP防污染系统。 7@uhw">mX   使用专用的精致移液器。 !{%BfZX<&   在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。
K]c\3[vR   体系有问题	Vx*O^ cM   酶浓度不对，Mg离子浓度不对
N(=Z4Nk5   定量PCR（染料法）出现非特异信号	H^r;,Q$9   引物二聚体多	AD^Q`7K?uR   检查引物设计和合成环节，必要时更改引物
c1aIZ   更换热启动酶	NY3.?@Z   热启动酶能增加反应的特异性，提高灵敏度
b:t|9FE%   设定检测信号时的温度	VBv|7S   在更高的温度下检测荧光信号（此时引物二聚体已经解链）
] CxDm   定量RT-PCR "cDMFu   无扩增产量 9mRP%c#(   相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照	s_}q   无cDNA合成	^Cy=L]
<e'/z3TbRW   cDNA合成温度太高	d`9ofw~3=   降低保温温度
h h7unHt-   反转录cDNA产物被二级结构封闭	;fe~PPT   提高保温温度。重新设计引物
Cm%|hk>fQ   RNA被损害或降解	%i5tf;x6i   必要的话更换RNA
jT=fq'RK   RNAse污染	7.FD16   维持无菌条件；加入RNase抑制剂
9v@P|   荧光探针无功能	H7%q[O   确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 )m_q2xV   用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 !xvAy3   必要的话设计和合成探针。
_lrvK99   灵敏度低 =*{Ii]D   须在比预期更高的循环中检出产物（Ct滞后）	`z$=J"%? y   初始模板RNA不充分	_E2 W%N   增加模板RNA的浓度；使用10ng-1µg的总RNA
*I.eCMDa   RNA被损害和降解	4^T_" W}   必要的话更换RNA
ZRj/lQ2D   RNAse污染	TeRH@oI   维持无菌条件；加入RNase抑制剂
_N:GZLG   无效的cDNA	wvRwb   通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
zl<D"eP   无效的PCR扩增	9Ed=`c   注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。 vj9'5] !~q   调整cDNA合成温度或引物设计
XhUVDmeUMb   检测使用仪器	+GncQs y   扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查，是整体滞后还是个别孔滞后
RFPcH8-u7   PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误	&v#pS!UOj   采用荧光探针法	sQ. t3a3m   增加结果特异性和产物的忠实性
o8Yq3N+   循环数太多	Z7>Nd$E{   降低循环数。
2!R+5^Iy   四种dNTP的浓度不同	\5}*;O@   制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。

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其他问题： E:dN)  
1）、文献上找到的引物和探针序列能否直接使用？ l@*$C&E  
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通常国外的文献可信度比较高，可直接使用；但为了保险起见，最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证；或者再进一步用primer软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析，这样更有利于您对整个实验的把握。 t&EizH$  
2）、在实验之前要进行哪些准备工作？ ej@4jpHQN  
首先要不加探针做常规的PCR实验，验证引物是否工作、模板是否降解、模板纯度是否合适，可以采用《通用PCR Master Mix 试剂盒》来缩短该过程。 ygj%VG  
3）、标本的采集和处理应该注意什么问题？ "igA^^?X1N  
根据实验要求和目的，有针对性采集病灶部位的标本；采集好的标本，最好根据每次实验用量，用冻存管分成几小份，放在－80℃保存，以免反复冻融；标本通常分成3类，如细胞组织、分泌物、血清全血；如果是血清，不能有融血现象的发生，否则会影响PCR的扩增；如果是全血，最好不用EDTA作为抗凝剂，选用柠檬酸作为抗凝剂，否则会影响PCR的扩增；如果是组织，最好用蛋白酶K消化；如果是提RNA的标本，更应该防止反复冻融和保持标本的新鲜。 gd]S;<J h  
4）、在做荧光定量实验时要注意些什么呢？ cu foP&  
见产品操作注意事项。 R!QR@*N  
5）、如果出现污染该怎么办？ ,Y
x<"2 W  
以替换法确定污染从何而来，对症下药，值得注意的是，因荧光定量PCR的敏感度极高，从防止污染的角度出发，最好在体系中加有dUTP，一旦出现污染现象，可以用UNG酶消除；同时将实验室分成4个区，即试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制、扩增和产物分析区。