荧光定量PCR实验指南 [复制链接]

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7、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析； Jcm&RI"{  
目前市场上有许多种实时PCR仪：其中包括ABI7700，ABI7900，ABI7000 (Alied Biosystems)；MX4000 (Stratagene)；iCycler (Bio-Rad)；Smartcycler(Cepheid)；Robocycler (MJ Research)；Lightcycler (Roche)；ROTORGENE(CORBERT) ；杭州博日（Linegene）。 =k`Cr0aPF  
不同的仪器使用方法有所区别，但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG（hot start）和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。 rK]Cr9WM  
为确保实验数据的有效性，每次实验都设阴性对照和4个标准品，每个样品都平行做2个复孔。 AvV|(K"  
基线或阀值的设定 通常是以10－15个循环的荧光值作为阀值，也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。 I(7NQ8Hx  
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8、疑难解答 xx9 g
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问 题	可能原因	建议解决方法
8MzVOF{"   定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量	aa#Y=%^   DNA模板质量不好，含有抑制剂	dS!:JO27   提高模板质量，诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA
jiS_G%G   PCR引物设计较差	yvHA7eq*"   避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
`e|0g"oP   探针设计较差	_Wp{[TH   对探针序列进行blast比对，设计符合要求的探针
6dN7_v)   PCR引物合成较差	LO khjHR   用普通电泳法，看引物的设计和合成质量，是否有目的条带出现。
;/fF,L{c   荧光探针无功能	`V]5sE]G   确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 YoZFwRQU   用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 Y*>#T   必要的话设计和合成探针。
!QHFg-=7   模板浓度太低	VsgE!/>1   使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。
(?`kYTw7g'   镁离子浓度太低	Nq` C.&   从3mM到5mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。
X1Ac*oLN   引物浓度太低	8X`tU<A b   最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。（见公式1）
HATA-M   选择优质酶进行扩增	:Jy'#c   选择hot start Taq酶进行扩增，可提高灵敏度，增加产量，降低干扰因素
VUYmz)m5   退火温度太高	;3: q?&   使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。
2eC(Ijq[a   反应物中有不明物干扰	{]_r W/   在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰，对任何实验样品或试剂，均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。
$m+sNEAa   定量PCR阳性对照无扩增曲线（针对：已经优化好的体系）	Z]WnG'3N   引物、探针设计合格；原来合成质量已经验证。需确认：	z=_Ef3`M   反应成分是否漏加；确定反应条件是否合适； WN5`; {\   正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题； MJCzo |w   确认体系：1、引物是否降解（看扩增产物是否可电泳出）来判断引物和酶功能；2、探针是否降解（用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强）。
{^rs#, W   仪器是否正常工作	G4;3cT3'
#gaQaUjR   定量PCR阴性对照一直有扩增曲线	[NIlbjYH   模板或PCR残余污染	.R8 HZ}3   隔离污染来源，更换试剂。 >'5_Y]h4m|   使用UNG/dUTP防污染系统。 5P+t^\   使用专用的精致移液器。 y}K\%;`[a   在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。
:!f(F9   体系有问题	hv$m4,0WB   酶浓度不对，Mg离子浓度不对
;t>Z+O%   定量PCR（染料法）出现非特异信号	(9mMkU=   引物二聚体多	b2^AP\: k   检查引物设计和合成环节，必要时更改引物
rf9_ eP   更换热启动酶	TfZ6F8|B   热启动酶能增加反应的特异性，提高灵敏度
tAFti+Qb   设定检测信号时的温度	RQvVR   在更高的温度下检测荧光信号（此时引物二聚体已经解链）
M}"r#Plq   定量RT-PCR xq- $\#O   无扩增产量 ]y)Q!J )Q   相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照	snp v z1iS   无cDNA合成	L8vOBI7N
^!;=6}YR   cDNA合成温度太高	?&h3P8   降低保温温度
~j@UlP   反转录cDNA产物被二级结构封闭	r.FLGDU   提高保温温度。重新设计引物
=!-5+I#e   RNA被损害或降解	O rk   必要的话更换RNA
U?U(;nSR\A   RNAse污染	K ar~I   维持无菌条件；加入RNase抑制剂
< ~% t$:   荧光探针无功能	135Par5v   确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 .wFU:y4r   用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 FH n,]Tfx   必要的话设计和合成探针。
mvf _@2^   灵敏度低 A. Nz_!   须在比预期更高的循环中检出产物（Ct滞后）	'{D%\w5{   初始模板RNA不充分	A1!:BC   增加模板RNA的浓度；使用10ng-1µg的总RNA
<<BQYU)Ig   RNA被损害和降解	xXa#J)'   必要的话更换RNA
}@4|7   RNAse污染	6(5c7R#   维持无菌条件；加入RNase抑制剂
e6es0D[>5   无效的cDNA	1'OD3~[R   通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
v*gLNB,ZH   无效的PCR扩增	].c@Gm_(   注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。 zrTY1Asw;4   调整cDNA合成温度或引物设计
OUKj@~T   检测使用仪器	_/8y1)I   扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查，是整体滞后还是个别孔滞后
Hm<M@M$aG   PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误	]s}aC9 I   采用荧光探针法	c[6zX#{`   增加结果特异性和产物的忠实性
.w=:+msL{(   循环数太多	W=!F8g |Qz   降低循环数。
t PAt?   四种dNTP的浓度不同	X~`.}   制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。

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其他问题： 2p[3Ap  
1）、文献上找到的引物和探针序列能否直接使用？ ~`fB\7M  
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=LzW#s=O  
通常国外的文献可信度比较高，可直接使用；但为了保险起见，最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证；或者再进一步用primer软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析，这样更有利于您对整个实验的把握。 C"WZsF^3  
2）、在实验之前要进行哪些准备工作？ Ca|;8ggf  
首先要不加探针做常规的PCR实验，验证引物是否工作、模板是否降解、模板纯度是否合适，可以采用《通用PCR Master Mix 试剂盒》来缩短该过程。 D._r@~o  
3）、标本的采集和处理应该注意什么问题？ (1vS)v $L  
根据实验要求和目的，有针对性采集病灶部位的标本；采集好的标本，最好根据每次实验用量，用冻存管分成几小份，放在－80℃保存，以免反复冻融；标本通常分成3类，如细胞组织、分泌物、血清全血；如果是血清，不能有融血现象的发生，否则会影响PCR的扩增；如果是全血，最好不用EDTA作为抗凝剂，选用柠檬酸作为抗凝剂，否则会影响PCR的扩增；如果是组织，最好用蛋白酶K消化；如果是提RNA的标本，更应该防止反复冻融和保持标本的新鲜。 WFG/vzJ  
4）、在做荧光定量实验时要注意些什么呢？ {\I\4P  
见产品操作注意事项。 X.qKG0i  
5）、如果出现污染该怎么办？ oef(i}8O@  
以替换法确定污染从何而来，对症下药，值得注意的是，因荧光定量PCR的敏感度极高，从防止污染的角度出发，最好在体系中加有dUTP，一旦出现污染现象，可以用UNG酶消除；同时将实验室分成4个区，即试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制、扩增和产物分析区。