荧光定量PCR实验指南 [复制链接]

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7、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析； tdw\Di#m  
目前市场上有许多种实时PCR仪：其中包括ABI7700，ABI7900，ABI7000 (Alied Biosystems)；MX4000 (Stratagene)；iCycler (Bio-Rad)；Smartcycler(Cepheid)；Robocycler (MJ Research)；Lightcycler (Roche)；ROTORGENE(CORBERT) ；杭州博日（Linegene）。 B"?+5A7  
不同的仪器使用方法有所区别，但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG（hot start）和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。 |1<]o;:  
为确保实验数据的有效性，每次实验都设阴性对照和4个标准品，每个样品都平行做2个复孔。 ]2aYi9)  
基线或阀值的设定 通常是以10－15个循环的荧光值作为阀值，也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。 &.+n L  
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8、疑难解答 (
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T/WmS?
 

问 题	可能原因	建议解决方法
v3hQv)j)   定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量	AihL>a%   DNA模板质量不好，含有抑制剂	1a=9z'8V   提高模板质量，诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA
YjX!q]56   PCR引物设计较差	R[>;_}5">   避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
*1o+o$hY2   探针设计较差	C+L_61    对探针序列进行blast比对，设计符合要求的探针
|=^#d\?]j   PCR引物合成较差	q j3bt_F!x   用普通电泳法，看引物的设计和合成质量，是否有目的条带出现。
8~[C'+r   荧光探针无功能	cyHaku+   确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 ;}>g1&q   用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 {xBjEhQm   必要的话设计和合成探针。
\y X !P1   模板浓度太低	]"7DV3_   使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。
@aiLGw h   镁离子浓度太低	Y)4Ny dq   从3mM到5mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。
B0oY]r6   引物浓度太低	WRcFE<   最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。（见公式1）
"$E!_   选择优质酶进行扩增	d*\C^:Z   选择hot start Taq酶进行扩增，可提高灵敏度，增加产量，降低干扰因素
Mly z><   退火温度太高	H-cBXp5z   使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。
Am0.c0h    反应物中有不明物干扰	gh #w%g1g   在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰，对任何实验样品或试剂，均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。
" ;R3260   定量PCR阳性对照无扩增曲线（针对：已经优化好的体系）	R&=GB\`:a   引物、探针设计合格；原来合成质量已经验证。需确认：	oCdOC5   反应成分是否漏加；确定反应条件是否合适； \2<yZCn   正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题； 0rm;)[SjF   确认体系：1、引物是否降解（看扩增产物是否可电泳出）来判断引物和酶功能；2、探针是否降解（用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强）。
Tx!m6B`Y   仪器是否正常工作	{!g.255+
CMG`'gT   定量PCR阴性对照一直有扩增曲线	9hs{uxwuEE   模板或PCR残余污染	_g`0td>N   隔离污染来源，更换试剂。 <9@]|   使用UNG/dUTP防污染系统。 zHs   使用专用的精致移液器。 h'y@M+c(   在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。
o&F.mYnqX   体系有问题	5B.??;xtaV   酶浓度不对，Mg离子浓度不对
' bw,K*   定量PCR（染料法）出现非特异信号	'lRHdD}s   引物二聚体多	'TN{8~Gt*   检查引物设计和合成环节，必要时更改引物
m',_kY3   更换热启动酶	&'yV:g3H   热启动酶能增加反应的特异性，提高灵敏度
MJ"Mn^:/   设定检测信号时的温度	iCSM1W3   在更高的温度下检测荧光信号（此时引物二聚体已经解链）
g+/U^JIc4l   定量RT-PCR n`KXJ?t   无扩增产量 e/Oj T   相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照	GK+\-U)v   无cDNA合成	[<fLPa
:lQjy@J   cDNA合成温度太高	{uM{5GSL   降低保温温度
z+D,:!yF   反转录cDNA产物被二级结构封闭	bfI -!,   提高保温温度。重新设计引物
tWOze, N   RNA被损害或降解	7%}3Ghc%   必要的话更换RNA
[k=9 +0p   RNAse污染	# +]! u%n   维持无菌条件；加入RNase抑制剂
p33GKg0i+(   荧光探针无功能	5a_!&   确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 RF2XJJ   用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 KJC9^BAr   必要的话设计和合成探针。
GO3YXO33   灵敏度低 E=*Q\3G~   须在比预期更高的循环中检出产物（Ct滞后）	q8bS@\i   初始模板RNA不充分	nJ})6/gK   增加模板RNA的浓度；使用10ng-1µg的总RNA
 Q<ExfJm   RNA被损害和降解	64>[pZF8   必要的话更换RNA
E d/O\v@   RNAse污染	fDHISJv   维持无菌条件；加入RNase抑制剂
i4r~eneP   无效的cDNA	uWj-tzu   通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
t6e-~   无效的PCR扩增	7Ej#7\TB]   注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。 h#ot)m|I   调整cDNA合成温度或引物设计
#7T={mh   检测使用仪器	-XG$ 0   扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查，是整体滞后还是个别孔滞后
XJ?z{gXJ   PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误	~(]DNXB8I`   采用荧光探针法	9cj-v}5j   增加结果特异性和产物的忠实性
Ud*[2Oi|R   循环数太多	becQ5w/~   降低循环数。
ppP?1Il`kb   四种dNTP的浓度不同	=V 7w CW   制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。

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其他问题： ?kSs7e>  
1）、文献上找到的引物和探针序列能否直接使用？ vhC"f*  
EA\~m*k  
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通常国外的文献可信度比较高，可直接使用；但为了保险起见，最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证；或者再进一步用primer软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析，这样更有利于您对整个实验的把握。 XV&3h>5  
2）、在实验之前要进行哪些准备工作？ {~S
R>I3sv  
首先要不加探针做常规的PCR实验，验证引物是否工作、模板是否降解、模板纯度是否合适，可以采用《通用PCR Master Mix 试剂盒》来缩短该过程。 `W9_LROD  
3）、标本的采集和处理应该注意什么问题？ jcj)9;n=!  
根据实验要求和目的，有针对性采集病灶部位的标本；采集好的标本，最好根据每次实验用量，用冻存管分成几小份，放在－80℃保存，以免反复冻融；标本通常分成3类，如细胞组织、分泌物、血清全血；如果是血清，不能有融血现象的发生，否则会影响PCR的扩增；如果是全血，最好不用EDTA作为抗凝剂，选用柠檬酸作为抗凝剂，否则会影响PCR的扩增；如果是组织，最好用蛋白酶K消化；如果是提RNA的标本，更应该防止反复冻融和保持标本的新鲜。 y}VKFRky  
4）、在做荧光定量实验时要注意些什么呢？  x^"OH  
见产品操作注意事项。 waC%o%fD  
5）、如果出现污染该怎么办？ X:A\{^~  
以替换法确定污染从何而来，对症下药，值得注意的是，因荧光定量PCR的敏感度极高，从防止污染的角度出发，最好在体系中加有dUTP，一旦出现污染现象，可以用UNG酶消除；同时将实验室分成4个区，即试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制、扩增和产物分析区。