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质粒DNA形态的电子显微镜观察 [复制链接]

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只看楼主倒序阅读使用道具楼主发表于: 2012-10-30

关键词： DNA 电子蛋白仪器

一、原理
球状蛋白质一般都可以在低盐溶液或蒸馏水表面形成不溶解的变性薄膜，若浓度合适，则肽链伸展形成蛋白质单分子层。一般用碱性蛋白质包围带负电的核酸分子，当蛋白质展开时，核酸也随之展开，核酸的形态结构将保持一定的完整性。然后将核酸分子捞到支持膜上，经过负染色，就可以在电镜下观察。
二、目的
观察质粒DNA在电镜下的形态，掌握质粒DNA的电镜制样原理和方法。
三、材料、试剂和仪器
　　1、纯化的质粒DNA样品。
　　2、火棉胶。
　　3、醋酸异戊酯。
　　4、干净铜网。
　　5、真空喷镀仪。
　　6、醋酸铀水溶液。
　　7、铂铱合金。
　　8、展开储备液(0.1mg/L细胞色素C，1mol/L醋酸铵)。
　　9、滑石粉。
　　10、电子显微镜。
四、操作步骤
　　1、称取3克火棉胶溶解于100ml的醋酸异戊酯中，制成3％的溶液。
　　2、用滴管吸取该液，滴1－2滴于清洁的水面上，当醋酸异戊酯挥发后，在水面上形成一层均匀的火棉胶膜。
　　3、用镊子小心地将干净的铜网间隔一定距离排列在膜上。
　　4、在这些铜网上轻轻覆盖一张适当大小的滤纸，待滤纸湿润后将滤纸连同铜网、火棉胶膜轻轻捞起，铜网向上放于一干净培养皿中晾干备用。
　　5、将核酸样品（浓度为5mg/ml-10mg/ml）加到展开溶液中，终浓度为1mg/ml-0.5mg/ml，作为上相液。
　　6、将重蒸水注入干净的培养皿中，作为下相液。
　　7、将干净的载玻片斜放在培养皿中，在水表面撒少量滑石粉，以指示单分子膜的展开情况。
　　8、取50ul左右的上相液，在离下相液表面1cm处轻轻滴到斜面上，使上相液缓缓触及下相液表面并形成一层单分子膜。
　　9、用镊子夹着铜网，膜面朝下，轻轻沾取下相液表面的核酸分子。用滤纸吸去多余的液体，晾干备用。
　　10、用醋酸双氧铀染色15分钟，蒸馏水洗3次，每次10分钟，晾干备用。
　　11、在真空喷镀仪中用铂铱合金投影，以进一步增加电子反差。
　　12、电镜观察。