测方法 otH[?c?BT #\S$$gP 1.实验部分: Jq<`j<'9 1.1材料、试剂 ^8*SCM_A Cleanert PEP吡咯烷酮化聚苯乙烯/二乙烯基苯固相萃取柱(100mg/6mL, P/N: PE1006,博纳艾杰尔科技);Cleanert Silica CM改性硅胶固相萃取柱 ( 1000mg/6mL , P/N : CM0006,博纳艾杰尔科技)
~+iJpW 液相色谱柱 (Halo C18 , 2.1×100mm, 2.7μm, P/N: 92812-602,博纳艾杰尔科技)
/(pD^D 标准品:雌酮(CAS.No. 53-16-7)、雌二醇(CAS.No. 50-28-2)、醋酸甲地孕酮(CAS.No. 595-33-5)、醋酸氯地孕酮 (CAS.No. 302-22-7 ),购自
中国药品生物制品检定所。
4e\`zy 1.2样品前处理方法 '2J6%Gg 1.2.1 Cleanert PEP样品提取净化法 ,u^0V"hJ 提取:取2g奶粉,加标,然后加12mL 80% 乙腈,涡旋混匀两分钟后,离心(90000r/min, 6min)取3mL上清液,加入9mL超纯水稀释,涡旋混匀后,待过Cleanert PEP柱净化。
=X5&au o 净化步骤:
:ItW| 1) 活化:以5mL乙腈,5mL水活化Cleanrt PEP;
T9<nD"=: 2) 上样:把上述稀释后的样品溶液过柱,流速控制以1mL/min为宜;
x[~OVG0M* 3) 淋洗:待样品溶液完全通过小柱后,用5mL 5%乙腈淋洗小柱,然后真空抽干3min;
^JVP2L>o* 4) 洗脱:以3-5mL乙腈洗脱目标,收集流出液;
(U(x[D
f) 5) 浓缩:收集液以氮气浓度吹干(40℃水浴),后以50% 甲醇水定容至1mL,混匀后过0.22μm微孔滤膜过,进LC-MS/MS分析。
>!F,y3"5S 1.2.2 Cleanert Silica样品提取净化法 (E(:F[.S 提取:取2g奶粉,加标,然后加12mL 乙腈,涡旋混匀两分钟后,离心(90000r/min, 6min)取3mL上清液,待过Cleanert Silica柱净化。
+5|nCp6||j 净化步骤:
q>4i0p8^ 1) 活化:以5mL乙腈活化Cleanrt Silica小柱;
:k/U7 2 2) 上样:把上述提取液过柱,收集流出液;
+F&]BZ 3) 淋洗:以5mL乙腈洗涤小柱,收集流出液;
9<c4y4#y 4) 浓缩:合并以上流出液液,以氮气浓度吹干(40℃水浴),后以50% 甲醇水定容至1mL混匀后过0.22μm微孔滤膜,进LC-MS/MS分析。
_W@Fk)E6N 1.3 LC-MS/MS检测条件 < LAD 1.3.1 孕激素(醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮)测定 z n8ig/C 液相色谱条件:色谱柱 (Halo C18, 2.1×100mm, 2.7μm);流动相:A:0.1%甲酸水,B: 甲醇,梯度条件(略);流速:0.3mL/min,柱温:40℃,进样量:10μL
Vzm+Ew
_ 参考质谱条件:电离源:电喷雾正离子模式;其他(略)
v+bjC 1.3.2 雌激素(雌二醇、雌酮)测定 Vy~$%H94 液相色谱条件:色谱柱(Halo C18 2.1×100mm,2.7μm);流动相:A:水,B: 乙腈,梯度条件(略);流速:0.3mL/min,柱温:40℃, 进样量:10μL
-gGK(PIf 参考质谱条件:电离源:电喷雾负离子模式;其他(略)
wO)KQ~ yX 2.结果与讨论: 0BE^qe 结果见图1、图2。用Cleanert PEP (反相)或Cleanert Silica CM(正相) 两种净化手段均可到达满意的回收率和净化效果,添加浓度在25ppb时回收率可达到80% 。
c7!`d.{90 用Halo色谱柱可以实现样品的快速分离,大大提高工作效率。
9<CUsq@i: 雌二醇和雌酮两种激素,质谱相应偏低,质谱条件需要进一步优化。
0)a?W,+O 6WcbJ_"mq 本实验结果采用单点定量判定,结果可能有失偏颇,详细数据需做基质添加标准曲线确证,方法的精密度,稳定性等亦需要进一步确证。
图1 两种孕激素总离子流图和选择离子流图(标品)
图2 两种雌激素总离子流图和选择离子流图(奶粉样品)