常规免疫、融合、克隆化方法检测转基因食品

　转基因食品检测中常常采用常规免疫、融合、克隆化方法制备出2株分泌抗CrylAc单克隆抗体的杂交瘤细胞株，均进行了染色体计数、免疫球蛋白亚型分类、腹水制各及抗体效价检验等初步鉴定。实验结果表明腹水效价比细胞培养上清效价高出200-400倍，是人规模生产CryIAc单克隆抗体的经济、高效途径。
　　由于蚩向的抗原决定簇在不同处理的实验条件'F会发生改变，从而影响单兜隆抗体对它的识别。因此，我们采用了间接ELISA和双抗体夹心ELISA两种方法鉴定单克隆抗体的灵敏度和交叉反应。二者的区别在于：间接ELISA是直接包被蛋白，完整的蛋白颗粒在包被液(pH9.6)的处理下会部分解离为Ⅱ基而优先包被在检测板上，结果是某些位于蛋白表面的抗原决定簇掖破坏，而某些隐藏在蛋白内部的抗原决定簇暴露出来。圾抗体夹心法首先包被抗体（CryIAc的多抗），蛋白通过抗原一抗体反应而连在抗体上，这就保证了蛋白颗粒的完整性．保护了蛋白表面的抗原决定簇。因此，双抗体夹心法对于检测单克隆抗体的株系特异性尤为重要，比间接ELISA更具准确性。但双抗体夹心法也有木足之处．如当抗原决定簇的数量很少时，包被抗体与被检测的单克隆抗体发生竞争，从而掩盖了单克隆抗体的反应。
　　CryIAc单克隆抗体的成功制各，可进一步提高转基因作物中CrylAc检测的灵敏度，使检测结果更趋于真实。将这两株单克隆抗体杂交瘤细胞通过胶体金标记技术，组装成试纸条，不但可以简化检测程序，而且更适合大规模检测，对此我们将做进一步的研究。
　　1．分别以CP4-EPSPS基因保守结构为依据设计引物，对人豆总DNA进行PCR搜寻，并对其进行克隆，克隆的序列分析表明，该片段与Monsanto公司网上的譬利基因具有98%的同源性。应用该片段制各地高辛标记探针，并分析探针杂交比率与探针含饿存在着…定的比率关系，这为研制检测DNA水平的转基冈成分试刺盒打F了基础。
　　2．通过磁性微粒连接BtCrylAc晶体蛋白抗体，配与其他成分共同组成Bt晶体蛋白CryIAc放射免疫检测试剂盒，不仅使检测反应时间缩短到40分钟，也使整个过程简单快捷，不需离心分离，也不需纯化样品．灵敏度达到lOOpg/ml，检测范围为lOOpg/ml～l，OOOng/ml。具有定量、快速、灵敏的特点。
　　3．建立了两株分泌抗BtCryIAc晶体蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其染色体数平均为96．分泌抗体稳定。抗体贬型为IgGc，对CrylAc的灵敏度是1.Ong/ml，与CryIAb的交叉反应率为0.25%，与Cry2A的交叉反应小于0.1%。腹水抗体亲合力常数为1.0928×lO'ul/mol，蛋白含量为4-6mg/ml。1C3和2F3两株细胞株分泌抗体效价较高。分别为1：2560和1：5120，腹水效价均为1：1024，000，为进一步开发出试纸条检测卡奠定了基础。