婴幼儿奶粉中双氰胺的检测方法（HPLC-UV和HPLC-MS/MS法） [复制链接]

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北京时间1月25日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写DICY或DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。 U%m,:b6V  
针对婴幼儿奶粉中基质复杂的特点，本方法加大了净化材料的用量，以获得了更好的净化效果。采用新一代的Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管（500mg/15mL，货号：MS-SQA02）和Venusil® HILIC液相色谱柱，建立了奶粉中双氰胺的MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。 ?3"lI,!0  
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1 实验部分 !-p5j3A4L  
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1.1 仪器、试剂与材料 RQ!kVM@  
高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。 "! m6U#^  
双氰胺标准品（CAS： 461-58-5；FW=84.08），新一代Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管，Venusil^® HILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。 Wi)Y9frE  
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1.2 实验步骤 'de&9\  
称取1g试样于50mL具塞离心管中，加2mL水，涡旋30s，加2ml乙腈涡旋30s。再往现有的提取液中加2mL乙腈，重复上述提取步骤。再将该提取步骤重复2次，得到共计约10mL的提取液。以4000r/min离心5min，将全部上清液加入新一代Cleanert® MAS-QuChERS管中（500mg/15mL），将MAS管上下晃动30s，然后涡旋30s后，8000r/min离心5min，取全部上清液（约10ml）于玻璃试管中，50℃下氮气吹干，加入1ml乙腈复溶，过0.22μm微孔滤膜，待测。 :tdN#m6&  
注：1.做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂，防止加标瞬间发生蛋白沉淀； 3c}@_Yn  
2.乙腈提取分4次，为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快，影响提取效果。 lvY[E9I0  
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1.3　实验条件 "A6m-xE~  
1.3.1高效液相色谱法（HPLC法）： _ VKBzOH  
色谱柱：Venusil® HILIC（5μm，100Å，4.6*250mm）； )%dxfwd6  
流动相： 10mmol/L乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=15: 85； &N:Iirg  
波长：220nm；进样量：10µl；柱温：30℃；流速：0.8mL/min。 %|AebxB'o  
1.3.2 LC-MS/MS法： OD]` oJ|  
（1）色谱条件： JuQwZ]3ed  
色谱柱：Venusil® HILIC（ 5μm，100Å，2.1*150mm）； %PM&`c98z7  
流动相：A：0.5mmol/L乙酸铵（pH=4.0） 4A"3C  
B：乙腈； >~:Md  
进样量：10µL；柱温：30℃；流速：0.3 mL/min。

时间，min	A%	B%
0	10	90
0.4	50	50
1.8	50	50
1.9	10	90
7	10	90

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G%iTL"6  
*备注：本文曾尝试过多种C18色谱柱，对双氰胺没有保留，需要使用离子对试剂，但是无法用于LC-MS/MS；也曾尝试过MERCK ZIC-HILIC柱，但是得到双氰胺的峰面积偏差较大，分析原因是其具有阳离子交换基团，对双氰胺有不稳定的死吸附。最后确定使用键合丙基酰胺的Venusil HILIC柱，以亲水作用色谱机理对双氰胺进行保留。 V^Y'!w\LGI  
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（2）质谱条件： ;`N h@*_  
质谱仪：API 4000+；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；CAD：8.00；CUR：20.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00；TEM：600.00。

药物名称	监测离子对	DP	EP	CE	CXP
双氰胺	85.1/68.1	71	10	41	6
	85.1/43.1	71	10	41	6

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注：带“____”的监测离子对为定量离子对。 =' uePM")  
2.结果与讨论 P9`R~HO'`  
2.1 高效液相色谱法： !]5}N^X  
2.1.1双氰胺的液相色谱图 wg %g(FO  
2.1.2实际样品基质加标的线性关系和检出限 0civXZgj  
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液； =
PU($  
分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为0.5µg/g，1µg/g，2µg/g，5.0µg/mL和10µg/g的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述色谱条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表4：

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	5.57min	Y=108.16X+27.827	0.9971	0.5µg/g

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2.1.3准确度和精密度 L!>nl4O>`  
选取市售某品牌婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表5

平行1	平行2	平行3	平均值	RSD
82.3%	85.5%	89.1%	85.63%	3.97%

U0gZf5;*  
=Ox}WrU~  
2.2 LC-MS/MS法 `78Bv>[A  
,AmwsXN"F  
2.2.1双氰胺的LC-MS/MS图 +D@5zq:5  
Y{D%v  
2.2.2实际样品基质加标的线性关系和检出限 %x
N${4)6  
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液； ak7kb75o  
分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL和200ng/mL的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述液质条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表6：

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	2.25min	Y=3859.1X+23694	0.9900	2ng/g

2.2.3准确度和精密度 DmpT<SI+!  
选取市售某婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。

平行1	平行2	平行3	平均值	RSD
82.5%	83.5%	89.3%	85.2%	4.31%