1、纯化的一般目标和方法 @|
z _&E
tguB@,O
首先,自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤(例如:匀浆、离心、硫酸铵沉淀等)成为稳定的可以用于色谱分离的样品。 }*:3]
F-m%d@P&X
然后进行捕获色谱(capture chromatography),主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的杂质,此步最关心的是流速和载量,常采用高载量、快流速凝胶。 3aqH!?rVU
OUBGbld
经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱(intermediate chromatography),目的是去除较难去除的杂质,此步最关心的是分辨率,常采用高分辨率的细颗粒凝胶。 zD{]3pg
|*bUcS<S
最后为了得到符合要求的最终产品,去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者降解片断,进行精制色谱(polishing chromatography),常采用具有高分辨率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。 u
BEwYQB
Y%
iqSY
2、纯化前的准备工作 B!RfPk1B<*
Nv5^2^Sc=
(1)样品稳定性试验a、测定样品在pH 2-9的稳定性;b、测定样品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸铵中的稳定性;c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性;d、测定样品在4-40℃的稳定性;e、室温下静置过夜,测定对蛋白水解酶的稳定性。 [:X@|,1V!L
E+L
7[
(2)样品预处理a、去除样品中颗粒物(0.45-0.22微米膜过滤或者10000 g离心15分钟) .<m]j;|6
N3G9o`k
b、去除样品中脂类( 10000 g离心15分钟或有机溶剂抽提) fK/:
rNN>tpZ}
c、去除样品中核酸(加入核酸酶消化或者使核酸沉淀) yY$^
R|t
Ca |}i+
d、抑制样品中蛋白水解酶(加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第一步分离或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白) s<