荧光定量PCR实验指南 [复制链接]

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7、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析； o xu9
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目前市场上有许多种实时PCR仪：其中包括ABI7700，ABI7900，ABI7000 (Alied Biosystems)；MX4000 (Stratagene)；iCycler (Bio-Rad)；Smartcycler(Cepheid)；Robocycler (MJ Research)；Lightcycler (Roche)；ROTORGENE(CORBERT) ；杭州博日（Linegene）。 ''Ec-b6Q-  
不同的仪器使用方法有所区别，但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG（hot start）和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。 &7u Ra1/R  
为确保实验数据的有效性，每次实验都设阴性对照和4个标准品，每个样品都平行做2个复孔。 Ayt!a+J  
基线或阀值的设定 通常是以10－15个循环的荧光值作为阀值，也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。 e-)1K  
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8、疑难解答 =PM
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{ F8,^+b|  

问 题	可能原因	建议解决方法
# |[@Due   定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量	FWTl:LqFO   DNA模板质量不好，含有抑制剂	VSFl9/5?   提高模板质量，诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA
PQ]N>'v-   PCR引物设计较差	Z@A1+kUS   避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
(oEA)yc|   探针设计较差	s >I}-=.(Q   对探针序列进行blast比对，设计符合要求的探针
`2    PCR引物合成较差	7z&u92dJI   用普通电泳法，看引物的设计和合成质量，是否有目的条带出现。
n\9*B##   荧光探针无功能	KrH;o)|   确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 }C#d;JC   用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 }cmL{S   必要的话设计和合成探针。
]!w52kF7   模板浓度太低	I =pdjD   使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。
SUhP e +   镁离子浓度太低	 ond/e&1   从3mM到5mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。
Kn|dnq|G   引物浓度太低	R8*4E0\br   最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。（见公式1）
e(A&VIp   选择优质酶进行扩增	+P.I r   选择hot start Taq酶进行扩增，可提高灵敏度，增加产量，降低干扰因素
"&F/'';0}E   退火温度太高	PnvLXE}F   使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。
k2;yl_7   反应物中有不明物干扰	7\lc aC@   在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰，对任何实验样品或试剂，均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。
4r$t}t gX   定量PCR阳性对照无扩增曲线（针对：已经优化好的体系）	NunT2JP.   引物、探针设计合格；原来合成质量已经验证。需确认：	`h#JDcT;a   反应成分是否漏加；确定反应条件是否合适； (ol 3vt   正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题； &#.&xc2sRZ   确认体系：1、引物是否降解（看扩增产物是否可电泳出）来判断引物和酶功能；2、探针是否降解（用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强）。
ww *F}}(   仪器是否正常工作	5Jp>2d
[gDvAtTZ 5   定量PCR阴性对照一直有扩增曲线	>n/QKFvV5   模板或PCR残余污染	h/ic-iH(>   隔离污染来源，更换试剂。 fpUX @b   使用UNG/dUTP防污染系统。 =n!8>8d   使用专用的精致移液器。 3:RZ@~u=   在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。
Z1zC@z4sUj   体系有问题	3[$VW+YV   酶浓度不对，Mg离子浓度不对
<JlKtR&nSo   定量PCR（染料法）出现非特异信号	-J:vYhq|g   引物二聚体多	y g7z?AZ   检查引物设计和合成环节，必要时更改引物
&fWZ%C7|jC   更换热启动酶	rB\UNXy   热启动酶能增加反应的特异性，提高灵敏度
e_e|t>nQ   设定检测信号时的温度	: f Wh7X3   在更高的温度下检测荧光信号（此时引物二聚体已经解链）
tfsG P]9$   定量RT-PCR ,}<v:!   无扩增产量 G{:L^2>   相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照	k0,~wn\#h   无cDNA合成	[}Nfs3IlBw
/bVI'fT   cDNA合成温度太高	nHhg#wR   降低保温温度
rv^j& X+EH   反转录cDNA产物被二级结构封闭	(mycUU%   提高保温温度。重新设计引物
6SpkeXL   RNA被损害或降解	edm&,ph]   必要的话更换RNA
'tOo0Zgc   RNAse污染	xv /w %   维持无菌条件；加入RNase抑制剂
3Z`oI#-x   荧光探针无功能	zE{.oi   确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 OUD<+i,   用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 V&gUxS]*   必要的话设计和合成探针。
atYm.qb   灵敏度低 upWq=_   须在比预期更高的循环中检出产物（Ct滞后）	K,J:i^2   初始模板RNA不充分	W}KtB1J   增加模板RNA的浓度；使用10ng-1µg的总RNA
J^u8d?>r   RNA被损害和降解	D:f0Wv   必要的话更换RNA
w+Ag!O}.L   RNAse污染	1Azigd0%   维持无菌条件；加入RNase抑制剂
&a O 3N   无效的cDNA	&B[$l`1   通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
;]| Z8#s   无效的PCR扩增	Hl]3F^{   注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。 D\>CEBt   调整cDNA合成温度或引物设计
WPLAh_fe   检测使用仪器	Riw#+#r]/   扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查，是整体滞后还是个别孔滞后
5`0tG;   PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误	\6*3&p   采用荧光探针法	w $pBACX   增加结果特异性和产物的忠实性
fH>]>2fS   循环数太多	(eSa{C\   降低循环数。
x?T/=C   四种dNTP的浓度不同	R9~%ORI#;   制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。

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其他问题： yM}b  
1）、文献上找到的引物和探针序列能否直接使用？ ZuF"GNUC  
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通常国外的文献可信度比较高，可直接使用；但为了保险起见，最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证；或者再进一步用primer软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析，这样更有利于您对整个实验的把握。 e_m
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2）、在实验之前要进行哪些准备工作？ "o.V`Bj  
首先要不加探针做常规的PCR实验，验证引物是否工作、模板是否降解、模板纯度是否合适，可以采用《通用PCR Master Mix 试剂盒》来缩短该过程。 "]*16t%Z%x  
3）、标本的采集和处理应该注意什么问题？ i=
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根据实验要求和目的，有针对性采集病灶部位的标本；采集好的标本，最好根据每次实验用量，用冻存管分成几小份，放在－80℃保存，以免反复冻融；标本通常分成3类，如细胞组织、分泌物、血清全血；如果是血清，不能有融血现象的发生，否则会影响PCR的扩增；如果是全血，最好不用EDTA作为抗凝剂，选用柠檬酸作为抗凝剂，否则会影响PCR的扩增；如果是组织，最好用蛋白酶K消化；如果是提RNA的标本，更应该防止反复冻融和保持标本的新鲜。 }2dz];bR  
4）、在做荧光定量实验时要注意些什么呢？ %g1{nGah  
见产品操作注意事项。 ':al4m"  
5）、如果出现污染该怎么办？ S-)mv'Al'F  
以替换法确定污染从何而来，对症下药，值得注意的是，因荧光定量PCR的敏感度极高，从防止污染的角度出发，最好在体系中加有dUTP，一旦出现污染现象，可以用UNG酶消除；同时将实验室分成4个区，即试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制、扩增和产物分析区。