荧光定量PCR实验指南 [复制链接]

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7、适用的荧光仪器、实验设计、荧光曲线和数据分析； '@#l/9
 
目前市场上有许多种实时PCR仪：其中包括ABI7700，ABI7900，ABI7000 (Alied Biosystems)；MX4000 (Stratagene)；iCycler (Bio-Rad)；Smartcycler(Cepheid)；Robocycler (MJ Research)；Lightcycler (Roche)；ROTORGENE(CORBERT) ；杭州博日（Linegene）。 5(y Q-/6C+  
不同的仪器使用方法有所区别，但都具备对Taqman 探针和sybgreen 染料法的检测波长和检测能力。QPCR MASTER Mix-UDG（hot start）和通用PCR Master Mix均适合在这些仪器上进行使用。 X{qa|6S,F  
为确保实验数据的有效性，每次实验都设阴性对照和4个标准品，每个样品都平行做2个复孔。 dV"K 
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基线或阀值的设定 通常是以10－15个循环的荧光值作为阀值，也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。 5ma~Pjt8}
 
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8、疑难解答 -yY]0  
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问 题	可能原因	建议解决方法
HE3x0H}o>   定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量	@3 4CaZ$k   DNA模板质量不好，含有抑制剂	mQ:5(]v   提高模板质量，诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA
QBTjiaYGa'   PCR引物设计较差	CSIsi]H   避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
Vxim$'x!   探针设计较差	U9yR~pw   对探针序列进行blast比对，设计符合要求的探针
|FZIUS{]   PCR引物合成较差	sTFRu   用普通电泳法，看引物的设计和合成质量，是否有目的条带出现。
<@H=XEn   荧光探针无功能	_iW-i   确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 Ck^jgB.7   用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 F7qQrE5bl   必要的话设计和合成探针。
V?+Y[Q   模板浓度太低	t[?O*>   使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。
)l*6zn`z   镁离子浓度太低	'P<T,:z?   从3mM到5mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。FQ-PCR MasterMix-UNG 试剂盒不需优化镁离子浓度。
:ODG]-QF   引物浓度太低	Fwv(J_'q   最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。（见公式1）
i2+vUl|;Z   选择优质酶进行扩增	] R  s   选择hot start Taq酶进行扩增，可提高灵敏度，增加产量，降低干扰因素
by%k*y   退火温度太高	~ J,e^$u   使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。
J`x!c9zg7   反应物中有不明物干扰	8rA?X*|S!   在各个反应物中存在不明物质对PCR进行干扰，对任何实验样品或试剂，均应采用无菌无酶无热源的离心管进行试剂的分装和使用。
pJ 7=" n   定量PCR阳性对照无扩增曲线（针对：已经优化好的体系）	W6[# q%o   引物、探针设计合格；原来合成质量已经验证。需确认：	!K$qh{n   反应成分是否漏加；确定反应条件是否合适； 9F^rXY.   正常标本是否能扩增来判断是对照的问题还是体系的问题； !Cv:,q   确认体系：1、引物是否降解（看扩增产物是否可电泳出）来判断引物和酶功能；2、探针是否降解（用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强）。
f.&((z?rC   仪器是否正常工作	o1(?j}:c|
9s}y*Vp   定量PCR阴性对照一直有扩增曲线	CnA 0 ^JX   模板或PCR残余污染	pNzSy"Y$   隔离污染来源，更换试剂。 <CnTiS#   使用UNG/dUTP防污染系统。 w0FkKJV   使用专用的精致移液器。 4pfv?!O j   在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。
|tkhsQ-;   体系有问题	`Ko6;s#   酶浓度不对，Mg离子浓度不对
k5%:L2FO   定量PCR（染料法）出现非特异信号	z`:uvEX0   引物二聚体多	rprtp5Cg   检查引物设计和合成环节，必要时更改引物
8"\g?/   更换热启动酶	;P{HePs=)   热启动酶能增加反应的特异性，提高灵敏度
]^63n/Twj   设定检测信号时的温度	nz=X/J6   在更高的温度下检测荧光信号（此时引物二聚体已经解链）
BWbM$@'x   定量RT-PCR -|l^- Qf!   无扩增产量 ,c%>M^d   相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照	)4hb%U   无cDNA合成	U2D E"
X L/?v" /   cDNA合成温度太高	c teUKK.|)   降低保温温度
D=w5Lks   反转录cDNA产物被二级结构封闭	Wb_'X |"u   提高保温温度。重新设计引物
z8 SrZ#mg   RNA被损害或降解	<_S>-;by   必要的话更换RNA
Ix;9D'^}   RNAse污染	?I6us X9$   维持无菌条件；加入RNase抑制剂
%"2;i@   荧光探针无功能	JsfX&dX0   确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 8y-Sd\0g   用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。 3|=9aM^x^   必要的话设计和合成探针。
k^ CFu   灵敏度低 "v @h   须在比预期更高的循环中检出产物（Ct滞后）	@z8,XW }   初始模板RNA不充分	T)"B35   增加模板RNA的浓度；使用10ng-1µg的总RNA
1}A1P&2>   RNA被损害和降解	n%o"n?e   必要的话更换RNA
DYJ F6O   RNAse污染	E2M|b   维持无菌条件；加入RNase抑制剂
;++CMTza]   无效的cDNA	%#!`>S)O   通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
wAC*D=Qj   无效的PCR扩增	#7!P3j   注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。 |5o0N8!b[   调整cDNA合成温度或引物设计
1]wx Ru   检测使用仪器	|D `r o   扩增仪温度检查和荧光仪器温度和信号检查，是整体滞后还是个别孔滞后
r|U'2+vn   PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误	%E\&9,   采用荧光探针法	y:6&P6`dx   增加结果特异性和产物的忠实性
*>x~`   循环数太多	GfEg][f   降低循环数。
~*WSH&ip   四种dNTP的浓度不同	K)m\x zT/   制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。

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其他问题： 7Yp;B:5@  
1）、文献上找到的引物和探针序列能否直接使用？ _[}r2,e  
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-'&4No  
通常国外的文献可信度比较高，可直接使用；但为了保险起见，最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证；或者再进一步用primer软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析，这样更有利于您对整个实验的把握。 n|`L>@aw,  
2）、在实验之前要进行哪些准备工作？ lN94 b3_W  
首先要不加探针做常规的PCR实验，验证引物是否工作、模板是否降解、模板纯度是否合适，可以采用《通用PCR Master Mix 试剂盒》来缩短该过程。 (5[|h  
3）、标本的采集和处理应该注意什么问题？ "5Oi[w&F5  
根据实验要求和目的，有针对性采集病灶部位的标本；采集好的标本，最好根据每次实验用量，用冻存管分成几小份，放在－80℃保存，以免反复冻融；标本通常分成3类，如细胞组织、分泌物、血清全血；如果是血清，不能有融血现象的发生，否则会影响PCR的扩增；如果是全血，最好不用EDTA作为抗凝剂，选用柠檬酸作为抗凝剂，否则会影响PCR的扩增；如果是组织，最好用蛋白酶K消化；如果是提RNA的标本，更应该防止反复冻融和保持标本的新鲜。 ;}),6R  
4）、在做荧光定量实验时要注意些什么呢？  `=b)fE  
见产品操作注意事项。 -Si'[5@  
5）、如果出现污染该怎么办？ V#jFjObTN  
以替换法确定污染从何而来，对症下药，值得注意的是，因荧光定量PCR的敏感度极高，从防止污染的角度出发，最好在体系中加有dUTP，一旦出现污染现象，可以用UNG酶消除；同时将实验室分成4个区，即试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制、扩增和产物分析区。