摘要:建立了同时检测化妆品中24种防腐剂含量的反相高效液相色谱法(RP2HPLC)。采用KromasilC18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,以磷酸盐缓冲溶液(pH=4.26)为流动相,梯度洗脱。样品经甲醇超声提取,然后采用RP2HPLC2二极管阵列检测法测定,对样品前处理和色谱条件进行研究和优化。方法的相对标准偏差为1.3%～3.3%;回收率为90.6%～97.8%;各种防腐剂的线性相关系数≥0.9997,具有较高的准确度和精密度,可用于化妆品中24种防腐剂含量的分析。
　　
　　1引言
　　化妆品中的防腐剂是为了使化妆品在生产、使用和保存过程中免受微生物污染的一类化妆品添加剂。但大多数防腐剂对人的皮肤会产生不同程度的刺激。因此,化妆品中防腐剂的用量必须以安全性作为前提。我国《化妆品卫生规范》对化妆品中防腐剂的使用浓度和范围做了相关的规定。目前,国内外对化妆品中防腐剂的测定一般多采用高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱质谱法、胶束电动色谱法、毛细管电泳法和伏安法等,而同时测定的防腐剂一般仅为4～8种,最多可同时测定18种,采用的方法均为气相色谱-质谱法。
　　本实验研究了化妆品中的24种常用防腐剂的样品前处理方法和HPLC分离条件,建立了化妆品中24种常用防腐剂同时检测的HPLC法。结果表明,本方法简便、快速、准确,应用于实际化妆品中防腐剂的测定,结果满意。
　　2实验部分
　　2.1仪器与试剂
　　高效液相色谱仪(美国Agilent1100系列),由四元低压泵、柱温箱、二极管阵列检测器及自动进样器组成;KQ-600型超声波清洗仪器(昆山市超声仪器有限公司)。
　　对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、水杨酸、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、苯甲醇、苯氧基乙醇、4-氯-3-甲苯酚、三氯生及三氯卡班(Sigma公司);苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸苯酯及溴硝丙醇(AcrosOrgnics公司);2,4-二氯-3,5-二甲酚、对羟基苯甲酸异丙酯、2-苯酚、4-氯-3,5-二甲酚、对羟基苯甲酸异丁酯及2-苄基-4-氯酚(东京化成工业株式会社);苯甲酸、山梨酸(国家标准物质中心)。乙腈为色谱纯,甲醇为优级纯;无水乙醇、四氢呋喃等试剂均为国产分析纯;Millipore超纯水。
　　2.2标准品混合溶液和供试品溶液的制备
　　分别准确称取一定量的24种防腐剂标准品,用甲醇溶液定容,配制成2g/L的标准储备液。分别移取一定体积的上述标准储备液至100mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配成混合标准储备液。准确称取化妆品0.2g(精确到0.001g)于50mL锥形瓶中,加入10mL甲醇,超声提取30min,取部分溶液放入离心管中,在离心机上以5000r/min高速离心10min后,取上清液经0.22μm滤膜过滤,滤液供RP-HPLC检测。
　　2.3色谱条件
　　色谱柱:伊利特KromasilC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:A.甲醇,B.0.025mol/LNaH2PO4溶液,pH4.26。线性梯度洗脱条件见表1。流速:1.0mL/min;柱温:25℃;检测波长:程序可变波长扫描;进样量:10μL。
　　3结果与讨论
　　3.1流动相的选择
　　3.1.1缓冲溶液pH的选择在24种防腐剂中,受pH影响的只有苯甲酸、山梨酸和水杨酸。因此,着重考察了不同pH值(2.5～5.5)对以上3种酸分离情况的影响。发现在pH4.26时,苯甲酸、山梨酸和水杨酸能与溴硝丙醇、苯甲醇、苯氧基乙醇和对羟基苯甲酸甲酯达到很好的分离,峰形良好。
　　3.1.2NaH2PO4浓度的选择在考察了0.01、0.025和0.05mol/LNaH2PO4溶液对分离的影响后,发现0.025mol/LNaH2PO4可达到较好的分离,且峰形良好。
　　3.2检测波长的选择
　　通过全波长扫描可得到24种物质各自的吸收图谱。综合各物质在不同波长下的响应值和不同波长对基线的影响,最终确定采用程序可变波长进行扫描,即根据不同组分的出峰顺序,在不同时间段,分别用各组分的最佳吸收波长进行检测,从而提高检测的灵敏度,达到最佳的扫描效果。
　　3.3样品提取方法的选择
　　3.3.1样品提取溶剂的选择在相同的色谱条件下,比较了甲醇、乙醇、四氢呋喃和流动相等4种溶剂对不同种类化妆品(膏霜类、水类、固体类)的提取效果。结果表明,乙醇和四氢呋喃提取后的色谱图在2.0～4.5min的色谱峰的峰形欠佳,无法准确计算溴硝丙醇和水杨酸的含量,而流动相提取口红时,不能将口红完全溶解,且在28.26min时基线干扰较大,影响被测物质含量的测定。从提取结果可看出,乙醇、四氢呋喃和流动相对某些物质的提取率偏低,而甲醇对各物质的提取率都较高,提取效果最佳,因此选择甲醇作为样品超声提取的溶剂。
　　3.3.2超声波提取时间的选择研究了10～60min不同时间段内,超声波的提取率。发现30min以上对提取率没有明显增大,且随着超声时间的延长,会使超声波仪器内的水温上升,导致某些易挥发的成分挥发,反而降低了提取率。所以,综合考虑,选择30min为超声提取时间。图1是24种防腐剂在确定的色谱条件下的液相色谱图。
　　3.4线性关系、检出限、回收率和精密度
　　在确定的最佳分离色谱条件下,配制一系列不同浓度的混合标